碧云天生物技术-BeyoTSA酪酰胺信号放大试剂盒(Tyramide-680)(P1396S)

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BeyoTSA™酪酰胺信号放大试剂盒(Tyramide-680)

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产品编号	产品名称	产品包装	产品价格
P1396S	BeyoTSA™酪酰胺信号放大试剂盒(Tyramide-680)	100次	998.00元

碧云天的BeyoTSA™酪酰胺信号放大试剂盒系列产品，英文名为BeyoTSA™ Tyramide Signal Amplification Kit，是一系列包含TSA Reaction Buffer、增强型免疫染色抗体洗脱液、DAPI染色液、组织自发荧光淬灭剂、抗荧光淬灭封片液和不同荧光酪酰胺底物的酪酰胺信号放大试剂盒。本系列试剂盒是基于酪酰胺信号放大技术，一抗用量少、荧光强度高、信号稳定，可用于多色标记，尤其适用于低丰度靶标和复杂样品的检测。本产品适用于石蜡或冰冻切片、细胞爬片或涂片等细胞或组织样品的多重荧光染色。

酪酰胺信号放大(Tyramide signal amplification)技术，简称TSA，也称催化信号放大(Catalyzed signal amplification/CSA、Catalyzed reporter deposition/CARD)技术，由于其信号放大及多重染色的特点，被广泛应用于IF (Immunofluorescence)、IHC (Immunohistochemistry)和ISH (In situ hybridization)等技术中，是检测细胞和组织中极低丰度或低丰度的靶抗原最灵敏的方法之一，在不损失样品分辨率的条件下可以显著提升靶抗原检测的精度和灵敏度。

图1.碧云天BeyoTSA™系列产品的检测原理图。图A为TSA技术的原理图，图B为BeyoTSA™多重荧光染色的流程图。

TSA是一种基于酶催化反应的高灵敏度信号放大技术，其主要原理是通过辣根过氧化物酶(HRP)催化酪酰胺底物(Tyramide-substrate，如Tyramide-488、Tyramide-Biotin等)生成含高活性自由基(Free radicals)的酪酰胺底物，即活性酪酰胺底物(Active Tyramide-substrate)，这些自由基与邻近蛋白质如酪氨酸残基(Tyrosine residues)共价结合，从而在目标位点附近(约0.1-1μm)沉积大量标记物(如特定的荧光探针或生物素等)，实现信号级联放大[1-3]。本系列试剂盒信号级联放大的原理请参考图1A。在第一轮一抗和二抗孵育以及TSA Reagent反应结束后，可以通过增强型免疫染色抗体洗脱液或热修复法去除非共价结合在靶抗原上的抗体复合物，同时又稳定保留共价结合的荧光探针。后续可不必考虑上一轮实验中抗体的交叉干扰，即可直接使用不同或相同种属来源的抗体进行后续轮次的孵育，从而标记其它靶抗原。如此重复循环染色，待所有抗体及对应酪酰胺底物孵育结束后，再进行所有染色结果的检测，实现同一个样品上的多重荧光染色(图1B)。

本系列试剂盒采用了TSA信号放大技术，极大提高了检测灵敏度。TSA技术具有极高的检测灵敏度和精度，可以用于传统方法无法检出的低丰度靶抗原的检测，大大降低抗体的用量。本系列试剂盒的检测效果可参考图2、3。

图2.碧云天BeyoTSA™系列产品的效果图示例。BeyoTSA™酪酰胺信号放大试剂盒(Tyramide-488) (P1382)检测NRK-52E细胞核蛋白的效果图。如图所示，经本试剂盒处理后NRK-52E细胞核蛋白的检测效果显著提升，TSA组信号放大效果约为对照组的100倍。注：NRK-52E细胞经免疫染色固定液(P0098)固定后使用免疫染色强力通透液(P0097)通透。实验检测效果因实验条件、检测仪器和抗体等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

图3.碧云天BeyoTSA™系列产品的效果图示例。BeyoTSA™酪酰胺信号放大试剂盒(Tyramide-555) (P1389)检测NRK-52E细胞内微管蛋白的效果图。如图所示，经本试剂盒处理后NRK-52E细胞内微管蛋白的检测效果显著提升，TSA组信号放大效果约达对照组的100倍。注：NRK-52E细胞经免疫染色固定液(P0098)固定后使用免疫染色强力通透液(P0097)通透。实验检测效果因实验条件、检测仪器和抗体等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本系列试剂盒与Thermo公司的Tyramide SuperBoost™ Kits with Alexa Fluor™ Tyramides属于同类型产品，使用效果基本一致。

对于组织切片、细胞爬片或涂片、96孔板细胞样品，按照每个样品需要50μl TSA染色工作液计算，本系列试剂盒小包装和中包装分别可用于100或400个样品的靶蛋白的荧光标记检测。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
P1375S-1	BeyoTSA™ Tyramide-350 (200X)	25μl
P1375S-2	TSA Reaction Buffer	25ml
P1375S-3	DAPI染色液	5ml
P1375S-4	组织自发荧光淬灭剂(首次使用前加3ml无水乙醇)	2ml (+3ml)
P1375S-5	抗荧光淬灭封片液	2ml
－	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
P1378S-1	BeyoTSA™ Tyramide-440 (200X)	25μl
P1378S-2	TSA Reaction Buffer	25ml
P1378S-3	DAPI染色液	5ml
P1378S-4	组织自发荧光淬灭剂(首次使用前加3ml无水乙醇)	2ml (+3ml)
P1378S-5	抗荧光淬灭封片液	2ml
－	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
P1382S-1	BeyoTSA™ Tyramide-488 (200X)	25μl
P1382S-2	TSA Reaction Buffer	25ml
P1382S-3	DAPI染色液	5ml
P1382S-4	组织自发荧光淬灭剂(首次使用前加3ml无水乙醇)	2ml (+3ml)
P1382S-5	抗荧光淬灭封片液	2ml
－	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
P1382M-1	BeyoTSA™ Tyramide-488 (200X)	100μl
P1382M-2	TSA Reaction Buffer	100ml
P1382M-3	DAPI染色液	20ml
P1382M-4	组织自发荧光淬灭剂(首次使用前加12ml无水乙醇)	8ml (+12ml)
P1382M-5	抗荧光淬灭封片液	8ml
－	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
P1386S-1	BeyoTSA™ Tyramide-532 (200X)	25μl
P1386S-2	TSA Reaction Buffer	25ml
P1386S-3	DAPI染色液	5ml
P1386S-4	组织自发荧光淬灭剂(首次使用前加3ml无水乙醇)	2ml (+3ml)
P1386S-5	抗荧光淬灭封片液	2ml
－	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
P1389S-1	BeyoTSA™ Tyramide-555 (200X)	25μl
P1389S-2	TSA Reaction Buffer	25ml
P1389S-3	DAPI染色液	5ml
P1389S-4	组织自发荧光淬灭剂(首次使用前加3ml无水乙醇)	2ml (+3ml)
P1389S-5	抗荧光淬灭封片液	2ml
－	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
P1389M-1	BeyoTSA™ Tyramide-555 (200X)	100μl
P1389M-2	TSA Reaction Buffer	100ml
P1389M-3	DAPI染色液	20ml
P1389M-4	组织自发荧光淬灭剂(首次使用前加12ml无水乙醇)	8ml (+12ml)
P1389M-5	抗荧光淬灭封片液	8ml
－	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
P1391S-1	BeyoTSA™ Tyramide-594 (200X)	25μl
P1391S-2	TSA Reaction Buffer	25ml
P1391S-3	DAPI染色液	5ml
P1391S-4	组织自发荧光淬灭剂(首次使用前加3ml无水乙醇)	2ml (+3ml)
P1391S-5	抗荧光淬灭封片液	2ml
－	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
P1391M-1	BeyoTSA™ Tyramide-594 (200X)	100μl
P1391M-2	TSA Reaction Buffer	100ml
P1391M-3	DAPI染色液	20ml
P1391M-4	组织自发荧光淬灭剂(首次使用前加12ml无水乙醇)	8ml (+12ml)
P1391M-5	抗荧光淬灭封片液	8ml
－	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
P1393S-1	BeyoTSA™ Tyramide-647 (200X)	25μl
P1393S-2	TSA Reaction Buffer	25ml
P1393S-3	DAPI染色液	5ml
P1393S-4	组织自发荧光淬灭剂(首次使用前加3ml无水乙醇)	2ml (+3ml)
P1393S-5	抗荧光淬灭封片液	2ml
－	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
P1393M-1	BeyoTSA™ Tyramide-647 (200X)	100μl
P1393M-2	TSA Reaction Buffer	100ml
P1393M-3	DAPI染色液	20ml
P1393M-4	组织自发荧光淬灭剂(首次使用前加12ml无水乙醇)	8ml (+12ml)
P1393M-5	抗荧光淬灭封片液	8ml
－	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
P1396S-1	BeyoTSA™ Tyramide-680 (200X)	25μl
P1396S-2	TSA Reaction Buffer	25ml
P1396S-3	DAPI染色液	5ml
P1396S-4	组织自发荧光淬灭剂(首次使用前加3ml无水乙醇)	2ml (+3ml)
P1396S-5	抗荧光淬灭封片液	2ml
－	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
P1399S-1	BeyoTSA™ Tyramide-750 (200X)	25μl
P1399S-2	TSA Reaction Buffer	25ml
P1399S-3	DAPI染色液	5ml
P1399S-4	组织自发荧光淬灭剂(首次使用前加3ml无水乙醇)	2ml (+3ml)
P1399S-5	抗荧光淬灭封片液	2ml
－	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，一年有效。其中BeyoTSA™ Tyramide-350/440/488/532/555/594/647/680/750、DAPI染色液和组织自发荧光淬灭剂须避光保存。

注意事项：

须根据实际检测设备荧光通道的具体参数选择合适的酪酰胺底物或多重染色试剂盒。BeyoTSA™ Tyramide-substrate的荧光光谱信息见附录。碧云天是以激发波长进行酪酰胺底物的命名，有些同类产品可能是以发射波长进行命名，请注意区别。

如果需要更多的TSA Reaction Buffer、增强型免疫染色抗体洗脱液、DAPI染色液、组织自发荧光淬灭剂和抗荧光淬灭封片液，可以单独向碧云天订购TSA Reaction Buffer (P1451)、增强型免疫染色抗体洗脱液(P1455)、DAPI染色液(C1006)、组织自发荧光淬灭剂(P0122)和抗荧光淬灭封片液(P0126)。酪酰胺底物单品、单标酪酰胺信号放大试剂盒及其它多重荧光染色试剂盒详见相关产品。

组织自发荧光淬灭剂第一次使用前请按照包装上的指示添加相应量的无水乙醇，混匀，并在瓶上做好标记。

荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

若短期内使用频繁，可置于4ºC保存，至少1-2周内有效。宜尽量减少反复冻融。

相关洗涤，建议在翘板摇床(也称侧摆摇床)上进行，推荐使用BeyoShaker™数字式翘板摇床(E6673)。

组织自发荧光淬灭剂对人体有害，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.自备试剂。
a.洗涤液：PBS (C0221A)或免疫染色洗涤液(P0106/P0106C/P0106L)。通常免疫染色洗涤液比PBS有更好的洗涤效果，能更好地降低染色背景。
b.固定和通透试剂：4%多聚甲醛固定液(P0099)或免疫染色固定液(P0098)；免疫染色通透液(Triton X-100) (P0096)或免疫染色强力通透液(P0097)。
c.抗原修复液：柠檬酸钠-EDTA抗原修复液(40X) (P0086)、柠檬酸钠抗原修复液(50X) (P0081)、改进型柠檬酸钠抗原修复液(50X) (P0083)等。关于碧云天生产的各种抗原修复液的主要特点和差异可参考我们的相关网页：
http://www.beyotime.com/support/antigen-retrieval-solution.htm。
d.内源性过氧化物酶封闭试剂：内源性过氧化物酶封闭液(P0100A/P0100B)或3%过氧化氢溶液。
e.抗原封闭试剂：免疫染色封闭液(P0102)、QuickBlock™免疫染色封闭液(P0260)或BSA、血清等。
f.所需一抗及相关二抗，推荐碧云天适用于免疫组化的高品质BeyoIHC™系列抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L) (A0208)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L) (A0216)等。
g.0.3%过氧化氢溶液。可以使用实验室比较常见的30%过氧化氢溶液，用水配制成0.3%过氧化氢溶液。
2.样品处理。
a.对于石蜡切片。
(a)脱蜡入水：二甲苯中脱蜡5-10分钟，换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。推荐使用环保脱蜡剂(二甲苯替代品) (ST975)替代二甲苯进行脱蜡。无水乙醇5分钟，90%乙醇2分钟，80%乙醇2分钟，70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。
(b)抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸钠抗原修复液(P0081/P0083)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。具体步骤可参考相应说明书的使用说明。
b.对于冰冻切片、细胞爬片或者细胞涂片。
根据实验需求选择合适的固定方法，4%多聚甲醛固定液(P0099)或免疫染色固定液(P0098)室温固定样品15分钟。洗涤液洗涤3遍，每次5分钟。使用0.1% Triton X-100、免疫染色通透液(Triton X-100) (P0096)或免疫染色强力通透液(P0097)室温通透样品5分钟。通透完毕后，洗涤液洗涤样品3次，每次5分钟。
c.对于多孔板中培养的细胞。
参考上述细胞爬片的处理方式进行固定、洗涤、通透和洗涤。
注：本步骤及后续的所有孵育和洗涤都建议在翘板摇床上进行，推荐使用BeyoShaker™数字式翘板摇床(E6673)。
3.内源性过氧化物酶的封闭。如下以石蜡切片、冰冻切片、细胞爬片或者细胞涂片为例进行说明，对于多孔板中培养的细胞需要适当调整液体用量，并且个别步骤也须适当酌情调整。
对于组织切片或一些其它样品，内源性过氧化物酶会导致一定程度的背景信号。使用免疫组化笔圈出组织，使用内源性过氧化物酶封闭液(P0100A/P0100B)或3%过氧化氢溶液对样品进行灭活处理，通常室温与样品孵育10-15分钟即可。免疫组化笔推荐碧云天的Liquid Blocker Super PAP Pen (免疫组化笔) (P0139)。
4.背景封闭。
使用免疫染色封闭液(P0102)、含BSA或血清的自制适当封闭液室温孵育样品60分钟，或使用QuickBlock™免疫染色封闭液(P0260)室温孵育样品10分钟。
5.一抗孵育。
使用上述封闭液、免疫染色一抗稀释液(P0103)或QuickBlock™免疫染色一抗稀释液(P0262)，参考一抗的使用说明稀释一抗到合适的浓度。使用稀释后的一抗在载玻片染色盒(FSR958/FSR960)或其它湿盒中室温与样品孵育1-2小时，或4ºC孵育过夜。孵育结束后，洗涤液洗涤样品3次，每次5分钟。
注1：TSA技术有更高的灵敏度和更强的信号，因此一抗使用浓度需适当降低，通常可在正常IHC使用的稀释比例的基础上再稀释2-10倍，以减少非特异性结合引起的背景荧光。对于特定一抗，初次检测时建议设置一抗不同稀释比例进行优化。
注2：高品质抗体非常关键，优先推荐使用碧云天的高品质BeyoIHC™系列抗体。
6.二抗孵育。
使用免疫染色(非荧光)二抗稀释液(P0110)、QuickBlock™免疫组化染色二抗稀释液(P0267)或适当的自制二抗稀释液，稀释一抗所对应种属的二抗至适当的浓度。使用稀释后的二抗室温与样品孵育30-60分钟。孵育结束后，洗涤液洗涤样品3次，每次5分钟。
注1：确保每轮孵育使用的二抗匹配对应一抗的种属来源。推荐碧云天的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L) (A0208)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L) (A0216)等二抗。
注2：TSA技术有更高的灵敏度和更强的信号，因此需要优化二抗使用浓度，可在正常免疫染色使用的稀释比例的基础上再进行进一步的稀释，以减少非特异性结合引起的背景荧光。对于特定二抗，初次检测时建议设置二抗不同稀释比例进行优化。
7.TSA染色工作液配制。
按照每个样品需50μl TSA染色工作液(TSA Staining Solution)，参考下表配制所需TSA染色工作液的总体积。配制好的TSA染色工作液如果置于4ºC或冰浴避光保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。

Samples	1	2	10	20
BeyoTSA™ Tyramide-substrate (200X)	0.25μl	0.5μl	2.5μl	5μl
0.3% Hydrogen Peroxide Solution	0.25μl	0.5μl	2.5μl	5μl
TSA Reaction Buffer	50μl	100μl	500μl	1000μl
Total Volume	~50μl	~100μl	~500μl	~1000μl

注1：BeyoTSA™ Tyramide-substrate (200X)融化后，建议先瞬时离心，使附着在管盖或管壁上的液体聚集于管底，然后再打开管盖。
注2：BeyoTSA™ Tyramide-substrate (200X)指BeyoTSA™ Tyramide-488、Tyramide-555、Tyramide-Biotin等酪酰胺底物，每一轮标记仅需一种酪酰胺底物。碧云天提供较为完整荧光波长的酪酰胺底物，除了本系列试剂盒内的Tyramide-substrate荧光染料组合之外，也可以根据所使用的荧光成像系统光源配置，选择其它合适的多重荧光染色试剂盒或单独的荧光酪酰胺底物，详见相关产品。
注3：TSA染色工作液中的BeyoTSA™ Tyramide-substrate (200X)的最终浓度需根据不同样品和实验结果进行优化，上表中的用量为推荐用量，可以在0.2-2X范围内摸索最佳工作浓度。
注4：如需进行多重荧光染色，为保证多重荧光染色效果，建议在进行多重标记实验之前分别测试各个抗体和BeyoTSA™ Tyramide-substrate的标记效果，即需要先进行单标测试，确定每个一抗单标都能做出较为理想的阳性效果后，再根据优化好的单标实验条件进行多重荧光。
注5：0.3% Hydrogen Peroxide Solution即0.3%过氧化氢溶液为自备，须使用未过期且妥善保存的过氧化氢溶液进行配制。
8.TSA标记。
TSA染色工作液室温与样品避光孵育10分钟。孵育结束后，洗涤液洗涤样品3次，每次5分钟。
注：如需进行多重荧光染色，后续需进行抗体洗脱及其它抗体标记，具体步骤参考TSA系列多重免疫荧光试剂盒，如BeyoTSA™三标四色多重荧光染色试剂盒(488/555/647/DAPI) (P1351)等。
9.染色效果观察。
反应完成后可在荧光显微镜下确认染色效果，注意用洗涤液覆盖样品，防止干片。
10.DAPI染色细胞核。
滴加DAPI染色液，覆盖住样品即可，避光室温孵育3-5分钟。去除DAPI染色液，洗涤液洗涤3次，每次5分钟。
11.自发荧光淬灭。
a.吸除洗涤液，用蒸馏水短暂冲洗组织切片。
b.每个切片滴加50μl组织自发荧光淬灭剂。可根据组织切片的大小自行适当调整使用量，但必需完全覆盖整个组织切片。
注：请注意核对首次使用前是否已经按照包装上的指示添加了相应量的无水乙醇并混匀，同时在瓶上做好标记。如果需要更多的组织自发荧光淬灭剂，可以另行订购碧云天的组织自发荧光淬灭剂(P0122)。
c.室温孵育5分钟。
注：对特定类型的组织样品通常必须优化孵育时间，以最大限度地淬灭自发荧光，而不明显影响特异性的免疫荧光。进行优化时，可取数个组织切片，在免疫荧光染色完毕之后加入本产品，孵育1、3、5、10、20、40、60分钟等不同时间(首次建议尝试孵育3、5和10分钟)，最终观察荧光成像效果。如果组织自发荧光仍然很强，可进一步延长孵育时间；如果孵育时间小于10分钟而特异性的免疫荧光下降十分明显，可将孵育时间减少为1-3分钟。
d.吸除组织自发荧光淬灭剂，用蒸馏水短暂冲洗。
12.封片。
吸除切片上溶液，用抗荧光淬灭封片液封片。如需更多的抗荧光淬灭封片液，可以另行订购碧云天的抗荧光淬灭封片液(P0126)。
13.镜检拍照。
使用荧光显微镜、共聚焦或多光谱成像系统在相应的荧光通道下观察并采集图像。BeyoTSA™ Tyramide-substrate及DAPI的荧光光谱信息见附录。
14.多重染色(选做)。
如需进行多重染色，可在步骤9“染色效果观察”后，参考碧云天的BeyoTSA™三标四色多重荧光染色试剂盒(488/555/647/DAPI) (P1351)说明书，进行抗体洗脱及后续的多轮标记等实验操作。
附录：
BeyoTSA™ Tyramide-substrate及DAPI的荧光光谱信息如下：

BeyoTSA™ Tyramide-substrate	Ex/Em (nm)	Fluorescence Color
BeyoTSA™ Tyramide-350	~350/448	Blue
BeyoTSA™ Tyramide-440	~429/475	Blue
BeyoTSA™ Tyramide-488	~488/515	Green
BeyoTSA™ Tyramide-532	~531/554	Yellow
BeyoTSA™ Tyramide-555	~550/561	Orange Red
BeyoTSA™ Tyramide-594	~585/609	Red
BeyoTSA™ Tyramide-647	~641/658	Far-Red
BeyoTSA™ Tyramide-680	~680/700	Near-infrared
BeyoTSA™ Tyramide-750	~750/780	Near-infrared
DAPI	~364/454	Blue

参考文献：
1.Hernandez S, Rojas F, Laberiano C, Lazcano R, Wistuba I, et al. Front Mol Biosci. 2021. 8:667067.
2.Harms PW, Frankel TL, Moutafi M, et al. Mod Pathol. 2023. 36(7):100197.
3.Lee CW, Ren YJ, Marella M, Wang M, et al. J Immunol Methods. 2020. 478:112714.
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P1415-25μl	BeyoTSA™ Tyramide-350 (200X)	25μl
P1418-25μl	BeyoTSA™ Tyramide-440 (200X)	25μl
P1423	BeyoTSA™ Tyramide-488 (200X)	25μl/100μl
P1426-25μl	BeyoTSA™ Tyramide-532 (200X)	25μl
P1429	BeyoTSA™ Tyramide-555 (200X)	25μl/100μl
P1432	BeyoTSA™ Tyramide-594 (200X)	25μl/100μl
P1435	BeyoTSA™ Tyramide-647 (200X)	25μl/100μl
P1437-25μl	BeyoTSA™ Tyramide-680 (200X)	25μl
P1439-25μl	BeyoTSA™ Tyramide-750 (200X)	25μl
P1451	TSA Reaction Buffer	100ml/500ml
P1453	免疫染色抗体洗脱液	50ml/250ml
P1455	增强型免疫染色抗体洗脱液	50ml/250ml
C1006	DAPI染色液	10ml/50ml/200ml
P0122	组织自发荧光淬灭剂	10ml/50ml
P0126	抗荧光淬灭封片液	5ml/25ml