使用说明：
1.自备试剂。
a.洗涤液：PBS (C0221A)或免疫染色洗涤液(P0106/P0106C/P0106L)。通常免疫染色洗涤液比PBS有更好的洗涤效果，能更好地降低染色背景。
b.固定和通透试剂：4%多聚甲醛固定液(P0099)或免疫染色固定液(P0098)；免疫染色通透液(Triton X-100) (P0096)或免疫染色强力通透液(P0097)。
c.抗原修复液：柠檬酸钠-EDTA抗原修复液(40X) (P0086)、柠檬酸钠抗原修复液(50X) (P0081)、改进型柠檬酸钠抗原修复液(50X) (P0083)等。关于碧云天生产的各种抗原修复液的主要特点和差异可参考我们的相关网页：
http://www.beyotime.com/support/antigen-retrieval-solution.htm。
d.内源性过氧化物酶封闭试剂：内源性过氧化物酶封闭液(P0100A/P0100B)或3%过氧化氢溶液。
e.内源性生物素封闭试剂：生物素检测封闭试剂盒(P0101)。
注：仅BeyoTSA™酪酰胺信号放大试剂盒(Tyramide-Biotin)需要进行内源性生物素的封闭。
f.抗原封闭试剂：免疫染色封闭液(P0102)、QuickBlock™免疫染色封闭液(P0260)或BSA、血清等。
g.所需一抗及相关二抗，推荐碧云天适用于免疫组化的高品质BeyoIHC™系列抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L) (A0208)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L) (A0216)等。
h.0.3%过氧化氢溶液。可以使用实验室比较常见的30%过氧化氢溶液，用水配制成0.3%过氧化氢溶液。
2.样品处理。
a.对于石蜡切片。
(a)脱蜡入水：二甲苯中脱蜡5-10分钟，换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。推荐使用环保脱蜡剂(二甲苯替代品) (ST975)替代二甲苯进行脱蜡。无水乙醇5分钟，90%乙醇2分钟，80%乙醇2分钟，70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。
(b)抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸钠抗原修复液(P0081/P0083)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。具体步骤可参考相应说明书的使用说明。
b.对于冰冻切片、细胞爬片或者细胞涂片。
根据实验需求选择合适的固定方法，4%多聚甲醛固定液(P0099)或免疫染色固定液(P0098)室温固定样品15分钟。洗涤液洗涤3遍，每次5分钟。使用0.1% Triton X-100、免疫染色通透液(Triton X-100) (P0096)或免疫染色强力通透液(P0097)室温通透样品5分钟。通透完毕后，洗涤液洗涤样品3次，每次5分钟。
c.对于多孔板中培养的细胞。
参考上述细胞爬片的处理方式进行固定、洗涤、通透和洗涤。
注：本步骤及后续的所有孵育和洗涤都建议在翘板摇床上进行，推荐使用BeyoShaker™数字式翘板摇床(E6673)。
3.内源性过氧化物酶的封闭。如下以石蜡切片、冰冻切片、细胞爬片或者细胞涂片为例进行说明，对于多孔板中培养的细胞需要适当调整液体用量，并且个别步骤也须适当酌情调整。
对于组织切片或一些其它样品，内源性过氧化物酶会导致一定程度的背景信号。使用免疫组化笔圈出组织，使用内源性过氧化物酶封闭液(P0100A/P0100B)或3%过氧化氢溶液对样品进行灭活处理，通常室温与样品孵育10-15分钟即可。免疫组化笔推荐碧云天的Liquid Blocker Super PAP Pen (免疫组化笔) (P0139)。
4.内源性生物素的封闭(选做)。
a.根据样品数量计算1X Biotin Blocking Buffer和1X Streptavidin/Biotin-Binding Blocking Buffer所需的用量，使用BSA、血清或免疫染色封闭液(P0102)等普通封闭液或QuickBlock™免疫染色封闭液(P0260)将生物素检测封闭试剂盒(P0101)中的Biotin Blocking Buffer (100X)和Streptavidin/Biotin-Binding Blocking Buffer (100X)分别稀释至1X，即得1X Biotin Blocking Buffer和1X Streptavidin/Biotin-Binding Blocking Buffer。
b.样品在固定、封闭、洗涤之后，加入一抗孵育之前，滴加适量1X Biotin Blocking Buffer，孵育10-30分钟。
c.用免疫染色洗涤液(P0106/P0106C/P0106L)充分洗涤后再滴加适量1X Streptavidin/Biotin-Binding Blocking Buffer，孵育10-30分钟。
注：如果用于稀释的封闭液为QuickBlock™免疫染色封闭液，推荐1X Biotin Blocking Buffer和1X Streptavidin/Biotin-Binding Blocking Buffer的孵育时间为10分钟；若用于稀释的封闭液为普通封闭液，则孵育时间为30分钟。
5.一抗孵育。
使用上述封闭液、免疫染色一抗稀释液(P0103)或QuickBlock™免疫染色一抗稀释液(P0262)，参考一抗的使用说明稀释一抗到合适的浓度。使用稀释后的一抗在载玻片染色盒(FSR958/FSR960)或其它湿盒中室温与样品孵育1-2小时，或4ºC孵育过夜。孵育结束后，洗涤液洗涤样品3次，每次5分钟。
注1：TSA技术有更高的灵敏度和更强的信号，因此一抗使用浓度需适当降低，通常可在正常IHC使用的稀释比例的基础上再稀释2-10倍，以减少非特异性结合引起的背景。对于特定一抗，初次检测时建议设置一抗不同稀释比例进行优化。
注2：高品质抗体非常关键，优先推荐使用碧云天的高品质BeyoIHC™系列抗体。
6.二抗孵育。
使用免疫染色(非荧光)二抗稀释液(P0110)、QuickBlock™免疫组化染色二抗稀释液(P0267)或适当的自制二抗稀释液，稀释一抗所对应种属的二抗至适当的浓度。使用稀释后的二抗室温与样品孵育30-60分钟。孵育结束后，洗涤液洗涤样品3次，每次5分钟。
注1：确保每轮孵育使用的二抗匹配对应一抗的种属来源。推荐碧云天的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L) (A0208)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L) (A0216)等二抗。
注2：TSA技术有更高的灵敏度和更强的信号，因此需要优化二抗使用浓度，可在正常免疫染色使用的稀释比例的基础上再进行进一步的稀释，以减少非特异性结合引起的背景荧光。对于特定二抗，初次检测时建议设置二抗不同稀释比例进行优化。
7.TSA染色工作液配制。
按照每个样品需50μl TSA染色工作液(TSA Staining Solution)，参考下表配制所需TSA染色工作液的总体积。配制好的TSA染色工作液如果置于4ºC或冰浴避光保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。

Samples	1	2	10	20
BeyoTSA™ Tyramide-Biotin (200X)	0.25μl	0.5μl	2.5μl	5μl
0.3% Hydrogen Peroxide Solution	0.25μl	0.5μl	2.5μl	5μl
TSA Reaction Buffer	50μl	100μl	500μl	1000μl
Total Volume	~50μl	~100μl	~500μl	~1000μl

注1：BeyoTSA™ Tyramide-Biotin (200X)融化后，建议先瞬时离心，使附着在管盖或管壁上的液体聚集于管底，然后再打开管盖。
注2：TSA染色工作液中的BeyoTSA™ Tyramide-Biotin (200X)的最终浓度需根据不同样品和实验结果进行优化，上表中的用量为推荐用量，可以在0.2-2X范围内摸索最佳工作浓度。
注3：0.3% Hydrogen Peroxide Solution即0.3%过氧化氢溶液为自备，须使用未过期且妥善保存的过氧化氢溶液进行配制。
8.TSA标记。
TSA染色工作液室温与样品避光孵育10分钟。孵育结束后，洗涤液洗涤样品3次，每次5分钟。
9.HRP-labeled Streptavidin孵育。
使用PBS (C0221A)稀释适量的HRP-labeled Streptavidin至适当的浓度(推荐按1:200稀释)，加入并室温孵育样品1小时。PBS或免疫染色洗涤液(P0106)洗涤样品2次，每次5分钟。
10.DAB显色工作液配制。
按每个样品需100μl DAB显色工作液的量配制适量的DAB显色工作液。取适量DAB Reagent A和DAB Reagent B按1:1的比例混合均匀，即得DAB显色工作液。
11.DAB显色。
DAB显色工作液室温避光孵育样品30分钟或更长时间，直至显色至预期深浅。蒸馏水洗涤样品1-2次即可终止显色。
12.染色效果观察。
反应完成后可在显微镜下确认染色效果，注意用蒸馏水覆盖样品，防止干片。
13.封片。
吸除切片上溶液，用中性树胶(镜检用长效封片剂) (C0173)或加拿大树胶(镜检用长效封片剂) (C0174)封片。
14.镜检拍照。
使用显微镜观察并采集图像。其它BeyoTSA™ Tyramide-substrate及DAPI的荧光光谱信息见附录。
15.多重染色(选做)。
如需进行多重染色，可在步骤12“染色效果观察”后，参考碧云天的BeyoTSA™三标四色多重荧光染色试剂盒(488/555/647/DAPI) (P1351)说明书，进行抗体洗脱及后续的多轮标记等实验操作。通常建议先进行Tyramide-Biotin反应，并进行严格的抗体洗脱和HRP失活操作，然后再进行多重荧光染色。
附录：
BeyoTSA™ Tyramide-substrate及DAPI的荧光光谱信息如下：

BeyoTSA™ Tyramide-substrate	Ex/Em (nm)	Fluorescence Color
BeyoTSA™ Tyramide-350	~350/448	Blue
BeyoTSA™ Tyramide-440	~429/475	Blue
BeyoTSA™ Tyramide-488	~488/515	Green
BeyoTSA™ Tyramide-532	~531/554	Yellow
BeyoTSA™ Tyramide-555	~550/561	Orange Red
BeyoTSA™ Tyramide-594	~585/609	Red
BeyoTSA™ Tyramide-647	~641/658	Far-Red
BeyoTSA™ Tyramide-680	~680/700	Near-infrared
BeyoTSA™ Tyramide-750	~750/780	Near-infrared
DAPI	~364/454	Blue

参考文献：
1.Hernandez S, Rojas F, Laberiano C, Lazcano R, Wistuba I, et al. Front Mol Biosci. 2021. 8:667067.
2.Harms PW, Frankel TL, Moutafi M, et al. Mod Pathol. 2023. 36(7):100197.
3.Lee CW, Ren YJ, Marella M, Wang M, et al. J Immunol Methods. 2020. 478:112714.
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