使用说明：
1.自备试剂。
a.洗涤液：PBS (C0221A)或免疫染色洗涤液(P0106/P0106C/P0106L)。通常免疫染色洗涤液比PBS有更好的洗涤效果，能更好地降低染色背景。
b.固定和通透试剂：4%多聚甲醛固定液(P0099)或免疫染色固定液(P0098)；免疫染色通透液(Triton X-100) (P0096)或免疫染色强力通透液(P0097)。
c.抗原修复液：柠檬酸钠-EDTA抗原修复液(40X) (P0086)、柠檬酸钠抗原修复液(50X) (P0081)、改进型柠檬酸钠抗原修复液(50X) (P0083)等。关于碧云天生产的各种抗原修复液的主要特点和差异可参考我们的相关网页：
http://www.beyotime.com/support/antigen-retrieval-solution.htm。
d.内源性过氧化物酶封闭试剂：内源性过氧化物酶封闭液(P0100A/P0100B)或3%过氧化氢溶液。
e.抗原封闭试剂：免疫染色封闭液(P0102)、QuickBlock™免疫染色封闭液(P0260)或BSA、血清等。
f.所需一抗及相关二抗，推荐碧云天适用于免疫组化的高品质BeyoIHC™系列抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L) (A0208)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L) (A0216)等。
g.0.3%过氧化氢溶液。可以使用实验室比较常见的30%过氧化氢溶液，用水配制成0.3%过氧化氢溶液。
2.样品处理。
a.对于石蜡切片。
(a)脱蜡入水：二甲苯中脱蜡5-10分钟，换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。推荐使用环保脱蜡剂(二甲苯替代品) (ST975)替代二甲苯进行脱蜡。无水乙醇5分钟，90%乙醇2分钟，80%乙醇2分钟，70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。
(b)抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸钠抗原修复液(P0081/P0083)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。具体步骤可参考相应说明书的使用说明。
b.对于冰冻切片、细胞爬片或者细胞涂片。
根据实验需求选择合适的固定方法，4%多聚甲醛固定液(P0099)或免疫染色固定液(P0098)室温固定样品15分钟。洗涤液洗涤3遍，每次5分钟。使用0.1% Triton X-100、免疫染色通透液(Triton X-100) (P0096)或免疫染色强力通透液(P0097)室温通透样品5分钟。通透完毕后，洗涤液洗涤样品3次，每次5分钟。
c.对于多孔板中培养的细胞。
参考上述细胞爬片的处理方式进行固定、洗涤、通透和洗涤。
注：本步骤及后续的所有孵育和洗涤都建议在翘板摇床上进行，推荐使用BeyoShaker™数字式翘板摇床(E6673)。
3.内源性过氧化物酶的封闭。如下以石蜡切片、冰冻切片、细胞爬片或者细胞涂片为例进行说明，对于多孔板中培养的细胞需要适当调整液体用量，并且个别步骤也须适当酌情调整。
对于组织切片或一些其它样品，内源性过氧化物酶会导致一定程度的背景信号。使用免疫组化笔圈出组织，使用内源性过氧化物酶封闭液(P0100A/P0100B)或3%过氧化氢溶液对样品进行灭活处理，通常室温与样品孵育10-15分钟即可。免疫组化笔推荐碧云天的Liquid Blocker Super PAP Pen (免疫组化笔) (P0139)。
4.背景封闭。
使用免疫染色封闭液(P0102)、含BSA或血清的自制适当封闭液室温孵育样品60分钟，或使用QuickBlock™免疫染色封闭液(P0260)室温孵育样品10分钟。
5.一抗孵育。
使用上述封闭液、免疫染色一抗稀释液(P0103)或QuickBlock™免疫染色一抗稀释液(P0262)，参考一抗的使用说明稀释一抗到合适的浓度。使用稀释后的一抗在载玻片染色盒(FSR958/FSR960)或其它湿盒中室温与样品孵育1-2小时，或4ºC孵育过夜。孵育结束后，洗涤液洗涤样品3次，每次5分钟。
注1：TSA技术有更高的灵敏度和更强的信号，因此一抗使用浓度需适当降低，通常可在正常IHC使用的稀释比例的基础上再稀释2-10倍，以减少非特异性结合引起的背景荧光。对于特定一抗，初次检测时建议设置一抗不同稀释比例进行优化。
注2：高品质抗体非常关键，优先推荐使用碧云天的高品质BeyoIHC™系列抗体。
6.二抗孵育。
使用免疫染色(非荧光)二抗稀释液(P0110)、QuickBlock™免疫组化染色二抗稀释液(P0267)或适当的自制二抗稀释液，稀释一抗所对应种属的二抗至适当的浓度。使用稀释后的二抗室温与样品孵育30-60分钟。孵育结束后，洗涤液洗涤样品3次，每次5分钟。
注1：确保每轮孵育使用的二抗匹配对应一抗的种属来源。推荐碧云天的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L) (A0208)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L) (A0216)等二抗。
注2：TSA技术有更高的灵敏度和更强的信号，因此需要优化二抗使用浓度，可在正常免疫染色使用的稀释比例的基础上再进行进一步的稀释，以减少非特异性结合引起的背景荧光。对于特定二抗，初次检测时建议设置二抗不同稀释比例进行优化。
7.TSA染色工作液配制。
按照每个样品需50μl TSA染色工作液(TSA Staining Solution)，参考下表配制所需TSA染色工作液的总体积。配制好的TSA染色工作液如果置于4ºC或冰浴避光保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。

Samples	1	2	10	20
BeyoTSA™ Tyramide-substrate (200X)	0.25μl	0.5μl	2.5μl	5μl
0.3% Hydrogen Peroxide Solution	0.25μl	0.5μl	2.5μl	5μl
TSA Reaction Buffer	50μl	100μl	500μl	1000μl
Total Volume	~50μl	~100μl	~500μl	~1000μl

注1：BeyoTSA™ Tyramide-substrate (200X)融化后，建议先瞬时离心，使附着在管盖或管壁上的液体聚集于管底，然后再打开管盖。
注2：BeyoTSA™ Tyramide-substrate (200X)指BeyoTSA™ Tyramide-488、Tyramide-555、Tyramide-Biotin等酪酰胺底物，每一轮标记仅需一种酪酰胺底物。碧云天提供较为完整荧光波长的酪酰胺底物，除了本系列试剂盒内的Tyramide-substrate荧光染料组合之外，也可以根据所使用的荧光成像系统光源配置，选择其它合适的多重荧光染色试剂盒或单独的荧光酪酰胺底物，详见相关产品。
注3：TSA染色工作液中的BeyoTSA™ Tyramide-substrate (200X)的最终浓度需根据不同样品和实验结果进行优化，上表中的用量为推荐用量，可以在0.2-2X范围内摸索最佳工作浓度。
注4：为保证多重荧光染色效果，建议在进行多重标记实验之前分别测试各个抗体和BeyoTSA™ Tyramide-substrate的标记效果，即需要先进行单标测试，确定每个一抗单标都能做出较为理想的阳性效果后，再根据优化好的单标实验条件进行多重荧光。
注5：0.3% Hydrogen Peroxide Solution即0.3%过氧化氢溶液为自备，须使用未过期且妥善保存的过氧化氢溶液进行配制。
8.TSA标记。
TSA染色工作液室温与样品避光孵育10分钟。孵育结束后，洗涤液洗涤样品3次，每次5分钟。
9.染色效果观察。
反应完成后可在荧光显微镜下确认染色效果，注意用洗涤液覆盖样品，防止干片。也可重复循环染色，待所有抗体及对应的TSA染色结束后，再进行所有染色结果的检测。
10.抗体洗脱(如下方法二选一，优先推荐使用增强型免疫染色抗体洗脱液进行洗脱)。
a.增强型免疫染色抗体洗脱液洗脱：滴加足量的增强型免疫染色抗体洗脱液覆盖整个样品，室温孵育10分钟。去除抗体洗脱液，洗涤液洗涤3次，每次5分钟。
注：本增强型免疫染色抗体洗脱液通常仅需洗脱一次且室温孵育即可，和普通的免疫染色抗体洗脱液相比，操作更简单、洗脱更高效、条件更温和，比高温热修复法洗脱更温和，可避免多次加热对样品形态结构造成损伤或破坏，同时可将一抗二抗复合物彻底洗脱去除，且石蜡切片、冰冻切片、细胞或骨组织等易脱落组织样品均可使用。
b.高温热修复法洗脱：组织切片置于盛满抗原修复液(请根据样品类型及抗体选择合适的抗原修复液)的染缸中95ºC水浴5-20分钟(最佳的加热时间需根据不同的样品和目的蛋白自行摸索)，以去除已经结合的一抗二抗复合物。洗脱过程中防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后洗涤液洗涤3次，每次5分钟。由于冰冻切片易脱片，本方法较适用于石蜡切片。
注1：抗体洗脱条件须根据实际效果进行洗脱方式的选择和优化。例如有些抗体效价高、亲和力较强，不易洗脱彻底，对于使用增强型免疫染色抗体洗脱液进行洗脱，可提高洗脱温度至37ºC或适当增加洗脱次数。
注2：最后一轮TSA染色后，可以不进行抗体洗脱。
11.第二轮标记。
重复步骤4至步骤10 (换用第二种一抗、对应二抗和相应的BeyoTSA™ Tyramide-substrate)，以进行第二轮标记。
12.第三轮标记。
重复步骤4至步骤10 (换用第三种一抗、对应二抗和相应的BeyoTSA™ Tyramide-substrate)，以进行第三轮标记。
13.第四轮标记。
重复步骤4至步骤10 (换用第四种一抗、对应二抗和相应的BeyoTSA™ Tyramide-substrate)，以进行第四轮标记。
14.第五轮标记。
重复步骤4至步骤10 (换用第五种一抗、对应二抗和相应的BeyoTSA™ Tyramide-substrate)，以进行第五轮标记。
15.DAPI染色细胞核。
滴加DAPI染色液，覆盖住样品即可，避光室温孵育3-5分钟。去除DAPI染色液，洗涤液洗涤3次，每次5分钟。
16.自发荧光淬灭。
a.吸除洗涤液，用蒸馏水短暂冲洗组织切片。
b.每个切片滴加50μl组织自发荧光淬灭剂。可根据组织切片的大小自行适当调整使用量，但必需完全覆盖整个组织切片。
注：请注意核对首次使用前是否已经按照包装上的指示添加了相应量的无水乙醇并混匀，同时在瓶上做好标记。如果需要更多的组织自发荧光淬灭剂，可以另行订购碧云天的组织自发荧光淬灭剂(P0122)。
c.室温孵育5分钟。
注：对特定类型的组织样品通常必须优化孵育时间，以最大限度地淬灭自发荧光，而不明显影响特异性的免疫荧光。进行优化时，可取数个组织切片，在免疫荧光染色完毕之后加入本产品，孵育1、3、5、10、20、40、60分钟等不同时间(首次建议尝试孵育3、5和10分钟)，最终观察荧光成像效果。如果组织自发荧光仍然很强，可进一步延长孵育时间；如果孵育时间小于10分钟而特异性的免疫荧光下降十分明显，可将孵育时间减少为1-3分钟。
d.吸除组织自发荧光淬灭剂，用蒸馏水短暂冲洗。
17.封片。
吸除切片上溶液，用抗荧光淬灭封片液封片。如需更多的抗荧光淬灭封片液，可以另行订购碧云天的抗荧光淬灭封片液(P0126)。
18.镜检拍照。
使用荧光显微镜、共聚焦或多光谱成像系统在相应的荧光通道下观察并采集图像。BeyoTSA™ Tyramide-substrate及DAPI的荧光光谱信息见附录。
附录：
BeyoTSA™ Tyramide-substrate及DAPI的荧光光谱信息如下：

BeyoTSA™ Tyramide-substrate	Ex/Em (nm)	Fluorescence Color
BeyoTSA™ Tyramide-350	~350/448	Blue
BeyoTSA™ Tyramide-440	~429/475	Blue
BeyoTSA™ Tyramide-488	~488/515	Green
BeyoTSA™ Tyramide-532	~531/554	Yellow
BeyoTSA™ Tyramide-555	~550/561	Orange Red
BeyoTSA™ Tyramide-594	~585/609	Red
BeyoTSA™ Tyramide-647	~641/658	Far-Red
BeyoTSA™ Tyramide-680	~680/700	Near-infrared
BeyoTSA™ Tyramide-750	~750/780	Near-infrared
DAPI	~364/454	Blue

参考文献：
1.Hernandez S, Rojas F, Laberiano C, Lazcano R, Wistuba I, et al. Front Mol Biosci. 2021. 8:667067.
2.Harms PW, Frankel TL, Moutafi M, et al. Mod Pathol. 2023. 36(7):100197.
3.Lee CW, Ren YJ, Marella M, Wang M, et al. J Immunol Methods. 2020. 478:112714.
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