碧云天讲堂Ⅱ：免疫染色
免疫染色(immunostaining)，包括任何基于抗原与抗体特异性结合的免疫学基本原理，检测蛋白等目的分子的技术方法。广义的免疫染色包括免疫组织化学(Immunocytochemistry, IHC) 、免疫细胞化学(Immunocytochemistry, ICC) 、免疫荧光 (Immunofluorescence, IF)，流式细胞仪分析(Flow cytometry)，免疫印迹(immunoblot, IB)即Western印迹(Western blot, WB)，酶联免疫反应(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和免疫电镜(Immuno-electron microscopy, IEM)等。狭义的免疫染色其检测样品仅限于保持原有形态的细胞或组织，通常包括免疫组化、免疫细胞化学、免疫荧光、流式细胞仪分析和免疫电镜，而不包括免疫印迹和酶联免疫反应。
免疫组织化学(Immunocytochemistry, IHC) ，即免疫组化，是指是应用抗原与抗体特异性结合的免疫学基本原理，最终通过化学反应显色来检测组织细胞内抗原，对其进行定位、定性及相对定量的研究方法。狭义的免疫组化，其检测的样品仅限于组织切片或者培养的组织，而广义的免疫组化其检测的样品也可以是培养的细胞。免疫细胞化学(Immunocytochemistry, ICC)和免疫组化相比，狭义的免疫细胞化学，检测对象是培养的细胞；而广义的免疫细胞化学，其检测对象可以是培养的细胞，也可以是组织切片或者培养的细胞和组织。狭义的免疫组化和免疫细胞化学最终都是通过显色反应来展示最终的检测结果的，而广义的免疫组化和免疫细胞化学也包括最终通过荧光等来展示最终的检测结果的，即也包括免疫荧光(Immunofluorescence，IF)。
免疫荧光(Immunofluorescence，IF)是一项建立在免疫学和荧光检测技术基础上的实验技术，依据抗原、抗体的反应原理进行组织或细胞内抗原物质的定位和半定量，是近代免疫学的一种重要研究手段。流式细胞仪分析(Flow cytometry)技术，也是一种免疫荧光检测技术。
免疫荧光技术有两种检测方法：用荧光标记抗体示踪或检测相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光标记抗原示踪或检测相应抗体的方法称荧光抗原法。其中以荧光抗体方法较常用。
免疫荧光实验原理
1.在开始实验研究前，有哪些因素需要考虑？
A：1.根据抗原选择合适的抗体：确认抗原可以识别哪一种异构体以及抗原表位的位置。2. 确认您的目的蛋白在该样本中是否表达（这里需要用到阳性对照）。3. 根据您所要研究的目标蛋白来确定合适的样本类型（石蜡切片、冰冻切片还是细胞制备物等）。4.选择抗体时需要考虑该抗体的物种交叉反应；5. 关于蛋白，您需要考虑它的组织定位和细胞定位，以及染色时是否应该有信号。6.选择合适的固定方法及抗原修复方法。7.抗体的工作浓度或稀释比例，以及抗体的物种来源也是需要考虑的重要因素。
2.免疫组化实验里为什么要对样品进行处理？
A：样品处理是为了调控样本中蛋白的表达水平。
如果是细胞实验，我们可能需要使用适当的抑制剂或激活剂来上调或下调细胞中某种蛋白质的表达。如果是体内实验，我们需要考虑更多的因素，因为实验对象是活的实验动物。在选择抑制剂或激活剂、激动剂或拮抗剂时，应尽量避免由于非特异性结合其它蛋白所导致的非特异性效应。
对于某些特殊试验样品，比如脑，我们需要确保细胞的渗透性，让化合物能真正进入细胞或血脑屏障。另外需要确保所使用的化学品能够溶于合适的溶剂。还有确定最适合的给药途径（注射或口服）。完成上述所有步骤之后，您就可以获取组织或细胞样品了。
3.请问如何根据具体的实验对象来选择不同的样本形式呢？
A：对于细胞制备物，它们常见的形式是涂片或培养的细胞系。对于组织样本，最常用的是石蜡包埋的组织切片，福尔马林固定。原因是它们能够保持组织形态与蛋白抗原性之间的最佳平衡。石蜡包埋的组织切片很稳定，并且易于使用。但它的不足之处是很耗时（需要对切片进行脱蜡处理和抗原修复）。一般来说，石蜡切片适用于 4 微米厚的切片。如果切片厚度大于4微米，抗体可能会被困住，导致假阳性染色，这是我们需要避免的。
另一种常见的样本形式是冰冻组织切片（IHC-FR），这对于不能经受醛固定处理和石蜡处理的抗原来说非常理想。因此这些抗原将呈现出更天然的状态。但冰冻切片的缺点是组织形态可能不佳，与石蜡切片相比，冰冻切片可能没那么好看。冷冻切片通常也仅适用于厚度为 4 到 10 微米的薄切片，超过这个厚度的切片可能会困住抗原，导致假阳性染色结果。 如果您所要研究的组织类型无法做成这种厚度的薄切片，可以考虑采用漂片。该技术一般用于脑组织和脊髓，在发育研究中，这是一项非常有用的技术。该技术可用于厚度达 40 微米的更大切片。它的缺点是操作起来更加不便，整个过程中组织样品都处于自由漂浮状态，最后还必须将它们固定在载玻片上进行观察，操作有一定的难度。它的另一个缺点就是非常耗时，尤其是应用于神经科学研究时，动物用 BFA 灌注，这显然也是有难度的一步。
4.免疫荧光直接法和间接法有什么区别？
A：直接法操作步骤少，但灵敏度不高，而间接法由于免疫球蛋白分子表面有多个抗原决定簇，可以结合多个荧光抗体分子，而起到放大作用，敏感性比直接法高出5-10倍。
间接法缺点：参与因素多，比直接法易出现非特异性荧光，故需严格优化、控制实验条件。
直接法只能测抗原，而间接法常用来测抗体，但也可测抗原。
5.应该使用哪种固定剂来固定自己的细胞或组织，从而进行抗体标记？
A：醛类固定剂（例如甲醛、戊二醛）可与各种细胞成分交联，这有助于保持蛋白质和细胞的形态。但一些抗原可能会因交联而被掩藏，需要通过抗原修复的方式暴露掩藏的抗原结合位点。此外，醛类固定剂需要通过通透处理使抗体进入细胞。甲醇和丙酮等有机溶剂可凝聚蛋白质并通透细胞，但细胞形态会受到破坏。表面抗原无需固定即可标记。
碧云天相关产品
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| P0095-100ml | 免疫染色通透液(Saponin) | 100ml |
| P0095-500ml | 免疫染色通透液(Saponin) | 500ml |
| P0096-100ml | 免疫染色通透液(Triton X-100) | 100ml |
| P0096-500ml | 免疫染色通透液(Triton X-100) | 500ml |
| P0097-100ml | 免疫染色强力通透液 | 100ml |
| P0097-500ml | 免疫染色强力通透液 | 500ml |
| P0098-100ml | 免疫染色固定液 | 100ml |
| P0098-500ml | 免疫染色固定液 | 500ml |
| P0099-100ml | 4%多聚甲醛固定液 | 100ml |
| P0099-500ml | 4%多聚甲醛固定液 | 500ml |
| P0081 | 柠檬酸钠抗原修复液(50X) | 100ml |
| P0083 | 改进型柠檬酸钠抗原修复液(50X) | 100ml |
| P0085 | EDTA抗原修复液(50X) | 100ml |
| P0086 | 柠檬酸钠-EDTA抗原修复液(40X) | 125ml |
| P0088 | 通用型强力抗原修复液(10X) | 100ml |
| P0090 | 冰冻切片快速抗原修复液(5X) | 100ml |
| P0092 | 漂片抗原修复液(10X) | 100ml |
6.一抗孵育的操作要点有哪些？
A：参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液(P0103)稀释一抗。用微型台式真空泵(E0110/E0113)吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。回收一抗,加入免疫染色洗涤液， 在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
7.我有两种来自于同一宿主种属的一抗，如果用他们来标记同一种细胞，该如何选择二抗？
A：如果这两种一抗来自不同亚型（如小鼠IgG1和IgG2a），则可选择该亚型特异性的二抗。另一种办法是通过抗体标记试剂盒、活性染料或定制标记，直接与一抗进行偶联反应。
8.该选用哪种封闭剂来阻止自己的抗体发生非特异性结合？
A：如果要封闭细胞或组织，可以使用2-5％的牛血清白蛋白（脱脂BSA）或是与二抗宿主种属相匹配的5-10％正常血清。其他选择还包括BSA和血清或其他纯化蛋白的混合物。碧云天提供一种快速高效免疫染色封闭液，总体效果显著优于传统的基于BSA(牛血清白蛋白)、血清等的封闭液及国外同类产品，背景极低且兼容性好。即QuickBlock™免疫染色封闭液（货号P0260）。
对于细胞或组织样品，要避免使用脱脂奶粉作为封闭剂，因为它含有大量的磷蛋白、组蛋白和生物素。
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| P0260 | QuickBlock™免疫染色封闭液 | 100ml |
| P0220 | Quickblock™封闭液(PBS) | 100ml |
| P0222 | Quickblock™封闭液(PBSTw) | 100ml |
| P0226 | Quickblock™封闭液(PBSTx) | 100ml |
| P0228 | Quickblock™封闭液(TBS) | 100ml |
| P0231 | Quickblock™封闭液(TBSTw) | 100ml |
| P0233 | Quickblock™封闭液(TBSTx) | 100ml |
| P0235 | Quickblock™封闭液(10X) | 100ml |
9.抗原丰度极低，如何放大信号？
A：放大抗体检测效果的常用方法是生物素-链霉亲和素检测，使生物素化的二抗结合偶联染料的链霉亲和素。该方法能够将信号放大约2-10倍，但在此之前必须先封闭内源性生物素。
碧云天的SABC系列试剂盒可以将IHC,ICC信号增强 5-10倍，灵敏度提高的同时可以为您大大节省一抗。
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| P0603 | SABC-HRP Kit (IHC, ICC, Blotting & ELISA) | 1000次 |
| P0606 | SABC-AP Kit (IHC, ICC, Blotting & ELISA) | 1000次 |
| P0612 | SABC-HRP Kit with Anti-Mouse IgG (IHC & ICC) | 500次 |
| P0615 | SABC-HRP Kit with Anti-Rabbit IgG (IHC & ICC) | 500次 |
| P0625 | SABC-AP Kit with Anti-Mouse IgG (IHC & ICC) | 500次 |
| P0628 | SABC-AP Kit with Anti-Rabbit IgG (IHC & ICC) | 500次 |
| A0279 | 生物素高效标记山羊抗兔IgG(H+L) | 0.5ml |
| A0288 | 生物素高效标记山羊抗小鼠IgG(H+L) | 0.5ml |
10.二抗孵育的操作要点有哪些？
A：参考二抗的说明书，按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液(P0108)稀释荧光标记的二抗，或者用免疫染色(非荧光)二抗稀释液(P0110)稀释辣根过氧化物酶(HRP)或生物素(Biotin)或碱性磷酸酯酶(AP)标记的二抗。辣根过氧化物酶(A0201/A0208/A0216)可向碧云天订购。
用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
回收二抗。加入免疫染色洗涤液， 在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| P0153 | 免疫荧光染色试剂盒-抗大鼠Cy3 | >300次 |
| P0166 | 免疫荧光染色试剂盒-抗人FITC | >300次 |
| P0173 | 免疫荧光染色试剂盒-抗山羊Cy3 | >300次 |
| P0175 | 免疫荧光染色试剂盒-抗兔Alexa Fluor 350 | >300次 |
| P0175A | 免疫荧光染色试剂盒-抗兔AMCA | >300次 |
| P0176 | 免疫荧光染色试剂盒-抗兔Alexa Fluor 488 | >300次 |
| P0179 | 免疫荧光染色试剂盒-抗兔Alexa Fluor 555 | >300次 |
| P0180 | 免疫荧光染色试剂盒-抗兔Alexa Fluor 647 | >300次 |
| P0183 | 免疫荧光染色试剂盒-抗兔Cy3 | >300次 |
| P0185D | 免疫荧光染色试剂盒-抗兔DyLight 405 | >300次 |
| P0186 | 免疫荧光染色试剂盒-抗兔FITC | >300次 |
| P0187 | 免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠Alexa Fluor350 | >300次 |
| P0187A | 免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠AMCA | >300次 |
| P0188 | 免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠Alexa Fluor 488 | >300次 |
| P0190 | 免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠Alexa Fluor 555 | >300次 |
| P0191 | 免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠Alexa Fluor 647 | >300次 |
| P0193 | 免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠Cy3 | >300次 |
| P0195D | 免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠DyLight 405 | >300次 |
| P0196 | 免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠FITC | >300次 |
11.多重染色与封片的目的是什么？
A：复染的目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位。也可以根据具体目的复染细胞膜或线粒体等。封片是为了便于长期保存。一般常用抗荧光淬灭封片液，缓冲甘油等（注意避免产生气泡）。
如果进行的是免疫荧光染色，通常都可以进行多重染色。对于可以产生有色沉淀物的染色反应，例如DAB染色，一般不适合再进行多重染色。
多重荧光染色：可使用红色荧光、绿色荧光和蓝色荧光进行三重荧光染色。例如用免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠Cy3(P0193)进行红色荧光染色，随后可以用免疫荧光染色试剂盒-抗兔FITC(P0186)进行绿色荧光染色，在完成上述两种染色后可以使用Hoechst染色试剂盒(C0003)对细胞核进行染色，染色后为蓝色荧光。
HE染色进行复染：免疫荧光染色后可以用苏木素伊红(HE)染色试剂盒(C0105)进行HE染色。
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| C0181 | Kisser封片液 | 10ml |
| C0183 | Kisser封片液(phenol free) | 10ml |
| C0185 | PVP封片液 | 10ml |
| C0187 | 甘油明胶封片液 | 10ml |
| P0123 | 抗荧光淬灭PVP封片液 | 5ml |
| P0126 | 抗荧光淬灭封片液 | 5ml |
| P0128 | 抗荧光淬灭封片液(强) | 5ml |
| C1005 | DAPI染色液 | 10ml |
| C1006 | DAPI染色液 | 50ml |
碧云天免疫染色其他相关产品：
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| P0100A | 内源性过氧化物酶封闭液 | 100ml |
| P0100B | 内源性过氧化物酶强力封闭液 | 100ml |
| P0100C | 内源性碱性磷酸酶封闭液 (20X) | 6ml |
| P0103 | 免疫染色一抗稀释液 | 100ml |
| P0106 | 免疫染色洗涤液 | 250ml |
| P0106C | 免疫染色洗涤液(10X) | 100ml |
| P0106L | 免疫染色洗涤液(10X) | 10×100ml |
| P0108 | 免疫荧光染色二抗稀释液 | 100ml |
| P0110 | 免疫染色(非荧光)二抗 稀释液 | 100ml |
| P0262 | QuickBlock?免疫染色一抗 稀释液 | 100ml |
| P0265 | QuickBlock?免疫荧光染色 二抗稀释液 | 100ml |
| P0267 | QuickBlock?免疫组化染色 二抗稀释液 | 100ml |
| P0202 | DAB辣根过氧化物酶显色 试剂盒 | 共20ml |
| P0203 | DAB辣根过氧化物酶 显色试剂盒 | 共100ml |
| P0209 | TMB显色液(ELISA HRP 显色用) | 100ml |
| P0211 | TMB显色液(组化或膜HRP 显色用) | 100ml |
| C3206 | BCIP/NBT碱性磷酸酯酶 显色试剂盒 | 共100ml |
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