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 BeyoRT™ II cDNA第一链合成试剂盒(RNase H-)

  产品编号D7168
  产品包装: 100次
  产品价格: 656.00元
产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
D7168 BeyoRT™ II cDNA第一链合成试剂盒(RNase H-) 100次 656.00元

      碧云天生产的BeyoRT™ II cDNA第一链合成试剂盒(RNase H-),即BeyoRT™II First Strand cDNA Synthesis Kit (RNase H minus),是一种采用了经过改造和优化的BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-),用于以总RNA、mRNA等为模板反转录合成cDNA第一链的试剂盒。本试剂盒包含了进行cDNA第一链合成所需的各种试剂。
      使用本试剂盒合成的第一链,可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR也称定量
PCR(quantitative PCR, qPCR)、cDNA的第二链合成以及cDNA文库的构建等。
      使用本试剂盒可以轻松完成长度为8 kb及以下基因的反转录(参考图1),反转录的最大长度可以超过10 kb。在采用BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-)的情况下,由于缺失了RNase H酶活性,RNA和DNA双链复合物中的RNA不会被降解,这样反转录出来的cDNA的长度就会更长,并且产量更高。

      图1. 使用本试剂盒对总RNA反转录后,对于不同长度的cDNA进行PCR扩增后的电泳效果图。图中可见对于0.2-8kb的cDNA可以非常高效地被反转录。

      本试剂盒中的BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-)热稳定性高,最适反应温度为42-45℃,但当温度达到50℃时仍具有很高活性,且可获得较高产量的cDNA。
      试剂盒中提供了RNase Inhibitor,确保在反转录过程中的RNA不会被RNA酶所降解并取得较好的反转录效果。
      试剂盒还提供了Oligo(dT)18和random hexamer这两种引物,前者适合用于带有Poly(A)尾的mRNA的反转录,后者进行反转录时不需要poly(A)尾。也可以自行采用基因特异性引物进行cDNA第一链的合成。
      本试剂盒用于体积为20微升的cDNA第一链合成反应时足够进行100个cDNA第一链样品的合成。
包装清单:

产品编号 产品名称 包装
D7168-1 BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-) 100μl
D7168-2 Reaction Buffer (5X) 0.5ml
D7168-3 RNase Inhibitor (20U/μl) 100μl
D7168-4 dNTP Mix (10 mM each) 200μl
D7168-5 Oligo(dT)18 Primer (0.5μg/μl) 100μl
D7168-6 Random Hexamer Primer (0.2μg/μl) 100μl
D7168-7 DEPC-treated Water 1.5ml
说明书 1份

保存条件:
      -20℃保存。
注意事项:
      对于GC含量比较高的RNA的反转录,产品的使用说明中都给予了特别说明,请予以关注。
      本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
      为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。 

使用说明:
1. cDNA第一条链的合成(First-stand cDNA Synthesis):
a. 参考如下表格设置反转录反应(RNase Inhibitor (R0102)和dNTP mix (D7373)可从碧云天订购):

模板(右侧3种任选其中一种) Total RNA 0.1 ng-5 μg
或poly(A) RNA/mRNA 10 pg-0.5 μg
或specific RNA 0.01 pg-0.5 μg
引物(右侧3种任选其中一种) Oligo(dT)18 primer 1 μl
或 Random Hexamer primer 1 μl
或 gene-specific primer 15-25 pmol
DEPC-treated Water To 12 μl*
选择性步骤:如果模板RNA的GC含量较高(例如大于55%)或者有比较严重的二级
结构,混匀后微离心以把液体沉降至管底,65℃孵育5min,随后立即置于冰上冷却,
以打开RNA中一些比较稳定的二级结构。
Reaction Buffer (5X) 4 μl
RNase Inhibitor (20U/μl) 1 μl
dNTP Mix (10mM each) 2 μl
BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-) 1 μl
总体积 20μl

*To 12μl表示加入DEPC-treated Water至最终体积为12μl。
b. 轻轻混匀(用移液器轻轻吹打混匀或用涡旋混合器在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
c. 如果使用Oligo(dT)18或基因特异性引物,42℃孵育60 min。如果使用random hexamer(随机六聚体)作为引物,先在25℃孵育10 min,随后在42℃孵育60 min。
注意:对于GC含量较高或二级结构比较严重的模板RNA,可以50℃孵育60 min,以充分利用本产品中的反转录酶在50℃时仍有良好活性这一特点,在较高温度进行反转录可以有效减少二级结构的干扰。
d. 80℃孵育10 min以失活BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-)并终止反转录反应。
说明:对于5kb以上的长片断cDNA不推荐采用加热的方法失活反转录酶,该方法易导致部分长片断DNA被剪切,此时可考虑酚氯仿抽提或柱纯化方法。
e. 反转录产物可以直接用于后续的PCR反应等,也可以-20℃冻存以备以后使用。用于后续PCR反应时,如果PCR的反应体系为 20和50微升,则推荐相应地使用0.8和2微升反转录产物。
2. 引物延伸、探针标记等其它用途请自行参考M-MLV反转录酶(RNase H-)的相关文献资料进行。
常见问题:
1. 总RNA反转录产物电泳观察不到。
反转录产物由于是从模板反转录而获得,而模板的量本身比较低,反转录的量通常还要少于模板量,并且总RNA的反转录产物大小很不均匀,因此通常总RNA的反转录产物直接电泳观察是观察不到的。
2. 反转录产物通过PCR扩增没有特异性条带。
a. PCR扩增没有获得特异性条带时建议先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增,看是否可以成功扩增。如果可以成功,则说明PCR扩增体系没有问题,此时通常是目的基因的引物设计欠佳,当然也有可能是反转录产物质量欠佳。如果内参不能被很好地扩增,则有可能PCR体系存在问题或反转录产物质量欠佳。
b. 模板RNA发生了降解。哺乳动物细胞或组织的总RNA琼脂糖电泳后应该可以看到清晰的18S和28S rRNA条带,并且28S rRNA和18S rRNA的亮度比例应该大于等于2.0。如果比例小于2.0,则提示总RNA发生了显著的降解,最好能重新制备总RNA样品。
避免RNA降解的主要方法是,严格进行RNA的相关操作,包括带洁净手套、戴一次性口罩、在洁净环境中抽提或制备RNA,以尽量避免RNase污染。
c. 模板RNA的纯度偏低。在提取纯化RNA的过程中,残留在溶液中的一些成分如苯酚、SDS、EDTA、胍盐、磷酸、焦磷酸、多胺、亚精胺等会抑制反转录酶活性。对RNA样品进行柱纯化,或者进行沉淀、洗涤和再溶解,通常可以有效去除残留的污染物。通常选择使用碧云天的BeyoZol或Trizol抽提获得的总RNA完全可以满足反转录反应的需要。
d. 反转录反应的模板量不足。在抽提获得总RNA后,在进行一些精细的定量检测时通常会进行DNase I消化,以充分去除可能的残留的DNA的干扰。DNase I进行热失活时,需要加入EDTA至终浓度为2.5mM,否则RNA在没有螯合剂的情况下,在加热过程中容易被水解,从而导致模板量不足。此外,扩增特定基因时,需要先查询该基因的组织分布特点,利用其高表达的组织进行目的基因的反转录和克隆。用该基因丰度极低的组织或细胞样品进行反转录和PCR扩增,通常会由于模板量过少而PCR扩增失败。
e. 没有使用适当的反转录引物。对于细菌RNA和不含poly(A)尾巴的RNA,要用random hexamer引物代替Oligo(dT)18引物。使用基因特异性反转录引物时,需要确保基因特异性引物设计合理正确。
f. 如果RNA模板富含GC或容易形成二级结构,此时可以考虑把反转录温度提高到45-50℃。

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产品编号 产品名称 包装
D7153 BeyoRT™ M-MLV反转录酶 2000U
D7159 BeyoRT™ M-MLV反转录酶(RNase H-) 2000U
D7160 BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-) 2000U
D7161 BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-) 10KU
D7162 BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-) 50KU
D7166 BeyoRT™ cDNA第一链合成试剂盒(RNase H-) 10次
D7167 BeyoRT™ II cDNA第一链合成试剂盒(RNase H-) 20次
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D7373 dNTP Mixture(25mM each) 250μl
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R0022 DEPC水(DNase、RNase free) 500ml
R0102 RNase Inhibitor 2000U
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使用本产品的文献:
1. Ren H, Zhu F, Zheng C, Sun X, Wang W, Shu H.
Transcriptome analysis reveals genes related to floral development in chrysanthemum responsive tophotoperiods.
Biochem Genet. 2013 Feb;51(1-2):20-32.
2.Bao W, Gu Y, Ta, Wang K, Xu Z.
Induction of autophagy by the MG 132 proteasome inhibitor is associated with endoplasmic reticulum stress in MCF 7 cells.
Mol Med Rep. 2016 Jan;13(1):796-804.
3. Zhang CG, Yang SD, Zhu WJ, You BG, Liu Y, Yuan ZQ, Chen WL, Li JZ, Zhou XF, Liu C , Zhang XN .
Distinctive polymer micelle designed for siRNA delivery and reversal of MDR1 gene-dependent multidrugresistance.
J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2016 Jul 13. doi: 10.1002/jbm.b.33748. [Epub ahead of print]
4.Li D, Chen J, Ye J, Zhai X, Song J, Jiang C, Wang J, Zhang H, Jia X, Zhu F .
Anti-inflammatory effect of the six compounds isolated from Nauclea officinalis Pierrc ex Pitard, and molecular mechanism of strictosamide via suppressing the NF-κB and MAPK signaling pathway in LPS-induced RAW 264.7 macrophages.
J Ethnopharmacol. 2017 Jan 20;196:66-74.