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 BeyoRT™ M-MuLV反转录酶(RNase H-)

  产品编号D7159
  产品包装: 2000U
  产品价格: 298.00元
产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
D7159 BeyoRT™ M-MuLV反转录酶(RNase H-) 2000U 298.00元

      BeyoRT™ M-MuLV反转录酶(RNase H-),即BeyoRT™ M-MuLV Reverse Transcriptase(RNase H minus)是一种经过改造和优化的M-MuLV反转录酶(RNase H-)。和普通的M-MuLV反转录酶相比,BeyoRT™ M-MuLV反转录酶(RNase H-)也是一种依赖于RNA或DNA模板的DNA聚合酶,可以以RNA或DNA为模板在引物存在的情况下完成互补DNA链的合成;但缺失了Ribonuclease H(RNase H)酶活性,不能够选择性剪切RNA和DNA杂合双链中的RNA。BeyoRT™ M-MuLV反转录酶(RNase
H-)是最常用的反转录酶之一。
      特点:BeyoRT™ M-MuLV反转录酶(RNase H-)可以合成长达13kb的cDNA,而普通的M-MuLV反转录酶(RNase H-)仅能合成长达9kb的cDNA;BeyoRT™ M-MuLV反转录酶(RNase H-)的最适反应温度为42-45℃并且在55℃时仍然有很高活性,可以避免普通的M-MuLV反转录酶(RNase H-)在37℃反应时的一些不足。
      用途:BeyoRT™ M-MuLV反转录酶(RNase H-)常用于在获得总RNA或mRNA后cDNA第一条链的合成。BeyoRT™ M-MuLV反转录酶(RNase H-)合成的cDNA第一条链后续可以用于PCR、real-time PCR、cDNA第二条链的合成等。BeyoRT™ 
M-MuLV反转录酶(RNase H-)也可以用于DNA探针的标记,通过引物延伸(primer extention)来分析RNA,以及用于基因芯片荧光探针的标记。
      来源:本BeyoRT™ M-MuLV反转录酶(RNase H-)由大肠杆菌表达,表达的基因为经过突变优化的编码Moloney Murine
Leukemia Virus reverse transcriptase的pol基因片段。
      活性定义:One unit of the enzyme incorporates 1 nmol of dTMP into a polynucleotide fraction in 10 min at 37℃. Enzyme activity is assayed in 50 mM Tris-HCl(pH 8.3), 6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 40 mM KCl, 0.5 mM dTTP, 0.4 MBq/ml [3H]-dTTP, 0.4 mM polyA·oligo(dT)12-18
      纯度:不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶和RNA酶,可以满足常规反转录合成cDNA第一条链等的需要。
      酶储存溶液:50 mM Tris, pH 8.3, 100mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 0.1% Triton X-100 and 50% glycerol。
      Reaction Buffer(5X):250 mM Tris, pH 8.3 at 25℃, 250 mM KCl, 20 mM MgCl2, 50 mM DTT。
      失活或抑制:70℃孵育10分钟可以导致BeyoRT™ M-MuLV反转录酶(RNase H-)失活;EDTA、EGTA等螯合剂、无机磷酸盐或焦磷酸盐以及聚氨(polyamine)对BeyoRT™ M-MuLV反转录酶(RNase H-)有抑制作用。
      本产品中BeyoRT™ M-MuLV反转录酶(RNase H-)的浓度为200U/μl,用于体积为20微升的反转录体系时足够进行10次反转录反应。 
包装清单:

产品编号 产品名称 包装
D7159-1 BeyoRT™ M-MuLV反转录酶(RNase H-) 2000U
D7159-2 Reaction Buffer(5X) 0.2ml
说明书 1份

保存条件:
      -20℃保存。
注意事项: 
      对于GC含量比较高的RNA的反转录,试剂盒的使用说明中给予了特别说明,请予以关注。
      本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
      为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。 

使用说明:
1. cDNA第一条链的合成(First-strand cDNA Synthesi):
a. 参考如下表格设置反转录反应:

模板(后面3种任选一种) Total RNA 0.01-5μg
或Poly(A) RNA/mRNA 1-500ng
或Specific RNA 0.01pg-500ng
引物(后面3种任选一种) Oligo(dT)18 0.5μg (或100pmol)
random hexamer 0.2μg (或100pmol)
Gene specific primer 15-25pmol
DEPC-treated Water To 13.7μl*
Reaction Buffer (5X) 4μl
RNase Inhibitor 0.5μl**
dNTP Mix (25 mM each) 0.8μl ***
BeyoRT™ M-MuLV反转录酶(RNase H-) 1μl
总体积 20μl

To 13.7μl表示加入DEPC-treated Water至最终体积为13.7μl。注意:对于GC含量比较高的RNA模板的反转录反应, 加入DEPC-treated Water混匀后微离心,接着可以在65℃孵育5分钟,随后立即置于冰浴以打开RNA的一些比较稳定的二级结构。
RNase Inhibitor可以视其本身的情况加入适当的量,例如0.5μl或其他适当体积。在加入其他体积时,DEPC-treated Water的用量需适当调整。
dNTP浓度不同时使用的体积需作适当调整,此时DEPC-treated Water的用量需适当调整。
b. 轻轻混匀(可以用Vortex在最低速度轻轻混匀或用移液器吹打混匀),随后离心沉淀液体。
c. 如果使用Oligo(dT)18作为引物或使用基因特异性引物,在42℃孵育60分钟。如果使用rando mhexamer(随机六聚体)作为引物,先在25℃孵育10分钟,随后在42℃孵育60分钟。注意:对于GC含量比较高的RNA模板的反转录反应,可以设置为45℃孵育60分钟。
d. 70℃孵育10分钟以失活BeyoRT™ M-MuLV反转录酶(RNase H-)并终止反转录反应。说明:对于长片段的cDNA不推荐采用加 热的方法失活BeyoRT™ M-MuLV反转录酶(RNase H-),这种操作可能会导致部分长片段 DNA被剪切。
e. 反转录产物可以直接用于后续的PCR等反应,也可以-20℃冻存以备以后使用。用于后续PCR反应时,如果PCR的反应体系为 50微升,则推荐使用2微升反转录产物。
2. 其他用途请自行参考M-MuLV反转录酶(RNase H-)的相关文献资料进行。
常见问题:
1. 总RNA反转录产物电泳观察不到。
反转录产物由于是从模板反转录而获得,而模板的量本身比较低,反转录的量通常还要少于模板量,因此通常总RNA的反转录产物直接电泳观察是观察不到的。
2. 反转录产物通过PCR扩增没有特异性条带。
PCR扩增没有获得特异性条带时建议先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增,看是否可以成功扩增。如果可以成功,则说明PCR扩增体系没有问题,此时通常是目的基因的引物设计欠佳,当然也有可能是反转录产物质量欠佳。如果内参不能被很好地扩增,则有可能PCR体系存在问题或反转录产物质量欠佳。

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