碧云天的BeyoClick™ Plus EdU-488细胞增殖检测试剂盒(BeyoClick™ Plus EdU Cell Proliferation Kit with AF488)，是一种基于DNA合成过程中胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidine)类似物EdU(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)的掺入，并通过随后的低铜点击反应(Click reaction)使EdU被AF488所标记，从而实现简单、快速、高灵敏地检测细胞增殖的试剂盒。本试剂盒和BeyoClick™ EdU-488细胞增殖检测试剂盒(C0071)等相比，保留了常规点击反应的全部优势，同时兼容对铜离子敏感的荧光蛋白如GFP、RFP、mCherry等的检测，也能兼容其它对于较高铜离子浓度可能存在干扰的检测。

AF488常被用作Alex Fluor 488的简称，甚至直接被简称为488，两者的分子式和荧光光谱一致。

本试剂盒可以检测到细胞或组织样品中单个的增殖细胞，同时也可以对细胞或组织样品总体的细胞增殖情况进行定量检测。本试剂盒可以检测培养的细胞或组织样品，也可以检测组织切片。

经本试剂盒处理后，增殖的细胞在荧光显微镜下呈现非常明亮的绿色荧光，可以用于荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪或荧光酶标仪检测，也可以用于高内涵筛选(High-Content Screening, HCS)。流式细胞仪或荧光酶标仪检测仅适用于细胞样品，不适用于组织切片。

细胞增殖能力的检测是评估细胞活性、基因毒性和抗肿瘤药物效果等的基本方法。公认的最精确的检测细胞增殖的方法是直接检测细胞中DNA的合成。最初广泛使用的通过检测DNA合成来检测细胞增殖的方法是放射性标记核苷掺入法，如氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷([3H]thymidine)掺入法。但该方法由于有放射性污染并且很难实现单细胞检测而受到很大的限制，随后逐渐被基于抗体检测的BrdU(bromo-deoxyuridine)法所替代。BrdU法步骤繁多，且需要使用BrdU抗体，影响因素较多，稳定性比较差。并且由于BrdU法需要使用抗体，有时会和其它目的蛋白基于抗体的检测相互产生干扰。EdU法基于EdU掺入和后续的点击反应，无需使用抗体、操作便捷、检测灵敏度高，是一种在BrdU法基础上升级换代的新方法，将会逐步取代BrdU法。

MTT法(C0009)、WST-1法(C0035/C0036)、CCK-8法(C0037-C0048)和CellTiter-Lumi™化学发光法(C0056-C0070)都是基于细胞活性的细胞增殖检测方法，能检测到细胞的总体增殖效果，但无法检测到单个的增殖细胞。这几种方法尽管都不是检测DNA合成的，但被广泛用于替代[3H]thymidine掺入法。CFDA SE法(C0051/C1031)基于细胞荧光示踪的原理能检测到单个的增殖细胞，但由于每增殖一次荧光减弱一半，在荧光显微镜下较难区分荧光减弱一半的细胞，检测灵敏度不是很高，通常仅适用于流式细胞仪检测。在进行科学研究时，上述这些基于细胞活性或CFDA SE的方法可以作为EdU法的补充性检测方法。

EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)，中文名为5-乙炔基-2'-脱氧尿苷，是一种新型胸苷(胸腺嘧啶脱氧核苷, thymidine)类似物，EdU可以在DNA合成过程中替代胸苷掺入到新合成的DNA中[1,2]。另一方面，EdU上的乙炔基能与荧光标记的小分子叠氮化物或吡啶甲基叠氮化物探针(如Azide/Picolyl Azide AF488、AF555、AF594、AF647等)通过一价铜离子的催化发生共价连接反应，形成稳定的三唑环，该反应非常迅速，被称作点击反应(Click reaction)，其反应原理参见图1。通过点击反应，新合成的DNA会被相应的荧光探针所标记，从而可以使用适当的荧光检测设备检测到增殖的细胞。

图1. BeyoClick™ EdU检测法中的点击反应(Click reaction)原理图。荧光探针等标记的叠氮化物(Labeled Azide)与掺入到细胞DNA中的EdU，在铜离子的催化发生共价反应，形成稳定的三唑环，最终使细胞DNA标记上荧光探针或其它探针。

本试剂盒反应简单、检测灵敏度高。本试剂盒基于简单高效的点击反应，无需DNA变性，只需少量的小分子叠氮化物探针即可非常有效地标记出掺入的EdU，并且可以检测到单个细胞的增殖情况。

本试剂盒使用便捷、兼容性好。本试剂盒只需常用的多聚甲醛固定和Triton X-100穿透，就可以使叠氮化物探针有效进入细胞并发生点击反应，不会影响细胞形态，不会影响基于抗体的免疫荧光和免疫组化检测，也不会影响DNA的荧光染色(如PI染色检测细胞周期、DAPI或Hoechst染料检测细胞核)。而BrdU法为了使大分子的BrdU抗体进入细胞并与DNA上的BrdU结合，需要对双链DNA进行变性处理(如酸变性、热变性或者DNase消化等)，这种变性可能会影响细胞形态，影响后续的免疫荧光和免疫组化检测、DNA的荧光染色等。BrdU法和BeyoClick™ EdU法检测原理的比较参见图2。

图2. BrdU法和BeyoClick™ EdU法检测原理的比较。A. BrdU法需使用大分子的BrdU抗体，由于空间位阻，双链DNA须变性后才能使BrdU抗体与BrdU结合。B. EdU法使用小分子标记的叠氮化物(Azide)，无需DNA变性，操作更便捷，兼容性好，检测结果更加稳定可靠。

本试剂盒兼容对较高铜离子浓度敏感的相关检测。游离的铜离子，无论是何种价态，都可能抑制多种酶(如辣根过氧化物酶)的活性、使蛋白质变性、使核酸断裂、促进多种生物分子沉淀，或催化产生活性氧而干扰检测，而且铜还能淬灭荧光蛋白、量子点和各种有机染料。常规的BeyoClick™ EdU细胞增殖检测试剂盒系列产品(C0071/C0075/C0078/C0081/C0085/ C0088)由于在点击反应时需要的铜离子浓度较高，会淬灭GFP、RFP、mCherry等荧光蛋白的荧光，因此需要在点击反应前先进行这些荧光蛋白的检测。本试剂盒使用吡啶甲基叠氮化物(Picolyl Azide)探针，带有内部铜离子螯合基团，其螯合作用可提高反应位点处铜离子的有效浓度，因此和常规的叠氮化物探针相比，可使用较低的铜离子浓度，既不影响标记效率，又避免了铜离子浓度过高引起的副作用，兼容各种荧光蛋白如GFP、RFP、mCherry及R-phycoerythrin (R-PE)和R-PE-tandems、Allophycocyanin (APC)和APC-tandems、PerCP和PerCP-tandems等染料，可进行多通路荧光检测。

本试剂盒检测快速，定性定量检测都非常便捷。相对于至少需要4小时的BrdU法，本试剂盒采用的BeyoClick™ Plus EdU法检测新合成的DNA只需1.5-2小时，时间上大大缩短。本试剂盒操作流程请参考图3。

图3. 碧云天BeyoClick™系列DNA合成检测试剂盒实验操作流程图。

本试剂盒同时提供了染色细胞核的Hoechst 33342，以方便染色观察所有的细胞核。可以使用荧光显微镜或流式细胞仪等进行定性和定量检测。HEK293细胞使用本试剂盒和荧光显微镜检测细胞增殖的效果参见图4；Jurkat细胞使用本试剂盒和流式细胞仪检测细胞增殖的效果参见图5。

图4. 碧云天BeyoClick™ Plus EdU-488细胞增殖检测试剂盒(C0072)和BeyoClick™ EdU-488细胞增殖检测试剂盒(C0071)用于HEK293细胞增殖检测的效果图。HEK293细胞转染pCMV-Cre-mCherry质粒(D2607)后显示红色荧光，加入EdU孵育2小时后被Azide 488标记显示绿色荧光，细胞核进行Hoechst 33342复染后显色蓝色荧光。BeyoClick™ Plus EdU组中的mCherry红色荧光和Azide 488绿色荧光都比较明亮，而BeyoClick™ EdU组中mCherry红色荧光明显变弱。实测数据可能会因细胞类型、转入的荧光蛋白、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

图5. Jurkat细胞使用本试剂盒标记后用流式细胞仪检测细胞增殖的效果图。Jurkat细胞无EdU标记(图A)或EdU标记(图B)，2小时后用本试剂盒进行点击反应，然后使用流式细胞仪进行检测。从图中可以看出，无EdU标记组中无绿色荧光阳性的细胞，而EdU标记的细胞有较高比例的绿色荧光(488 fluorescence)阳性细胞，呈现绿色荧光阴性和阳性的两个峰，分别对应于未增殖细胞和增殖细胞。该检测结果说明DNA合成时，EdU的掺入正常，可以成功用于检测细胞增殖。实测数据可能会因细胞类型、细胞增殖情况、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

碧云天各种细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒的比较和选择，请参考http://www.beyotime.com/support/cell-proliferation.htm。

本试剂盒小包装如果用于培养的细胞(6孔板)的检测，可以检测50个样品，每个样品的反应体系为500μl的Click反应液；如果用于96孔板检测，可以检测500个样品，每个样品的检测体系为50μl的Click反应液；如果用于12孔、24孔、48孔或384孔板样品的检测，分别可以检测125、250、350和1250个样品，每个样品推荐的Click反应液用量为200μl、100μl、70μl和20μl。小包装如果用于流式细胞仪检测，可以检测50个样品，每个细胞样品的细胞数量宜为10-100万，每个样品的反应体系为500μl的Click反应液。小包装如果用于冰冻或石蜡切片的检测，可以检测125-250个样品，每个样品的反应体系为100-200μl的Click反应液。大包装可检测样品的数量为小包装的4倍。

-20ºC保存，一年有效。Picolyl Azide 488和Hoechst 33342 (1000X)须避光保存。

Click Additive配制成溶液后请注意适当分装。如果溶解后有白色物质析出，请上下颠倒多次，待全部溶解后使用。如果该溶液颜色变成棕色，说明该组分的有效成分已失效，请弃用。

如果需要使用羟基脲(Hydroxyurea)作为对照，可以从碧云天订购(S1961 Hydroxyurea (DNA Synthesis抑制剂))。

如果用于动物实验需要更多EdU，也可以从碧云天订购(ST067 EdU)。

本产品与BeyoClick™ EdU试剂盒和相比，兼容较低的铜离子浓度，除了兼容有机类荧光染料如Alexa Fluor® (AF)系列、Fluorescein (FITC)、Allophycocyanin (APC)及APC-tandems染料、Cy® dyes、PerCP及PerCP-tandems等；还兼容各种荧光蛋白如GFP、RFP、mCherry、R-phycoerythrin (R-PE)和R-PE-tandems等；对于Qdot®纳米探针、Horseradish peroxidase (HRP) 等，需要在点击反应完成后进行反应和检测。由于Phalloidin (鬼笔环肽)不兼容点击反应，推荐使用Actin抗体进行细胞微丝的检测。

如遇到使用本试剂盒不兼容GFP、RFP、mCherry等荧光蛋白时，建议在固定、通透后先观察荧光蛋白的荧光是否正常，某些融合的荧光蛋白可能自身在固定、通透后就会出现荧光信号减弱的情况，而非点击反应时的铜离子导致的。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。