使用说明：
1.样品的准备：
a.血液样品的准备：对于血清样品，将全血在常温如25ºC下放置30分钟至2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素或者EDTA进行抗凝，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上，如果不能立即检测，也可以分装并短期保存于-20ºC或-80ºC。对于冻存的样品，在检测前解冻后冰浴存放备用，使用前必须混匀。后续采用吸光度法检测样品时，通常每个样品需要使用1-25μl；采用荧光法检测样品时，通常每个样品需要使用0.25-2.5μl。
b.细胞或组织样品的准备：对于培养的贴壁细胞，PBS (C0221A)洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100-500×g, 5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每20-100万细胞加入100-200μl的比例加入BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay或异丙醇，适当吹打。对于贴壁细胞适当吹打使细胞脱离培养器皿并转移至离心管中。对于组织样品，按照每10-20mg组织加入100-200μl的比例加入BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay或异丙醇。对于培养的细胞和组织，推荐把体积控制在100-200μl使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下进行匀浆；也可以考虑把体积放大到400-500μl左右，采用瓷珠机械震荡的方式进行匀浆；或者也可以使用常规的玻璃匀浆器进行匀浆(建议尽量使用较小的玻璃匀浆器，以便于把样品的体积控制在较小体积范围内)。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后继检测。
注1：异丙醇制备的样品使用检测缓冲液至少稀释5倍后(即50μl待测样品中异丙醇的含量不高于20%)再用于后续检测。
注2：以上所有操作均需在4ºC或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以-20ºC或-80ºC冻存。
注3：异丙醇容易挥发，由于操作时间过长导致异丙醇的挥发，后续可以将异丙醇补足至初始体积，然后再进行样品的检测；所有样品的挥发程度接近的情况下，可以统一不再补足挥发掉的异丙醇，但计算样品中的浓度时需要考虑到挥发掉的异丙醇的体积。如果样品已经用甲醇/氯仿或者氯仿抽提制备，可以充分干燥后用异丙醇把样品溶解，然后用检测缓冲液至少稀释5倍后再用本试剂盒进行检测。
c.细胞培养上清样品的准备：对于贴壁细胞，直接吸取培养液；对于悬浮细胞，离心后吸取培养液。
2.试剂盒的准备：
a.融解棕榈酸标准溶液(1mM)和检测缓冲液，平衡至室温后混匀备用。棕榈酸标准溶液(1mM)如果有油脂析出，需要在50-80ºC水浴加热5-10分钟，使棕榈酸标准溶液(1mM)完全溶解。其它试剂存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
b.游离脂肪酸检测工作液(Working Solution)的配制：按照每个反应50µl的体积配制适量的游离脂肪酸检测工作液。均匀混合44µl检测缓冲液(Free Fatty Acid Assay Buffer)、2µl Amplex Red、2µl酶混合物A (Enzyme Mix A)、2µl增强剂(Enhancer)，即可配制成50µl游离脂肪酸检测工作液。根据待检测样品(包括标准品)的数量，配制适量的游离脂肪酸检测工作液。具体配制方法参考下表。配制好的游离脂肪酸检测工作液如果置于4ºC或冰浴避光保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。

Samples	1	10	20	50
Free Fatty Acid Assay Buffer (µl)	44	440	880	2200
Amplex Red (μl)	2	20	40	100
Enzyme Mix A (µl)	2	20	40	100
Enhancer (µl)	2	20	40	100
Working Solution (µl)	50	500	1000	2500

注：由于酶溶液的用量较少且易沉降，必须注意在使用前先轻轻离心一下，然后适当混匀后再使用。
3.样品测定：
a.棕榈酸标准曲线设置(吸光度检测或荧光检测，可选取其中的一种，对于样品量较少的情况，优先推荐采用荧光检测)。
(a)吸光度检测：取20μl棕榈酸标准溶液(1mM)，加入180μl检测缓冲液、裂解液或含适量异丙醇的检测缓冲液(如果检测血液、上清等无需处理的样品，可以使用检测缓冲液；如果检测BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay制备的细胞或组织样品，可以使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay；如果是检测异丙醇制备的细胞或组织样品，可以使用和样品中异丙醇含量相同的检测缓冲液，但50μl标准品中异丙醇的含量不得超过20%)，混匀，配制成浓度为100μM的棕榈酸标准溶液。分别取100μM的棕榈酸标准溶液0、5、10、20、30、40、50µl加入96孔板的标准品孔中，并相应地用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay、缓冲液或含适量异丙醇的检测缓冲液补足到50µl，此时，标准曲线的浓度分别为0、10、20、40、60、80、100µM。
注：吸光度检测时建议使用透明96孔板(FPT010/FPT011)。
(b)荧光检测：取15μl棕榈酸标准溶液(1mM)，加入135μl检测缓冲液、裂解液或含适量异丙醇的检测缓冲液(如果检测血液、上清等无需处理的样品，可以使用检测缓冲液；如果检测BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay制备的细胞或组织样品，可以使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay；如果是检测细胞或组织样品，可以更加精准地使用和样品中异丙醇含量相同的检测缓冲液，但50μl标准品中异丙醇的含量不得超过20%)，混匀，配制成浓度为100μM的棕榈酸标准溶液。分别取100μM的棕榈酸标准溶液0、1、2.5、5、10、25、50µl加入96孔板的标准品孔中，并用检测缓冲液、裂解液或含适量异丙醇的检测缓冲液补足到50µl，此时，标准曲线的浓度分别为0、2、5、10、20、50、100µM。
注：荧光检测时建议使用96孔黑板(FCP965/FCP966)。
b.加入1-50µl稀释后的样品到96孔板样品孔中，并相应地再加入检测缓冲液、裂解液或含适量异丙醇的检测缓冲液至样品孔中，补足到50µl。同时设置仅含检测缓冲液、裂解液或含适量异丙醇的检测缓冲液的孔为空白对照。
注：为确保数值在标准曲线范围内，采用吸光度检测时，组织样品可用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay或含适量异丙醇的检测缓冲液稀释10-20倍；采用荧光检测时，组织样品可稀释100倍左右。血清等样品用检测缓冲液同时稀释多个倍数。可以进行预实验确定样品的大致浓度，如果数值不在标准曲线范围内，请调整样品的稀释倍数或者增加样品的量。样品总稀释倍数记录为n (包括步骤1b中的稀释倍数。例如1b中的稀释倍数为5，本步骤中又对样品进行了10倍稀释，加入的“稀释后的样品”为25µl，则n=5×10×50/25=100)。注意：用异丙醇制备的细胞或组织样品，检测时50µl样品中的异丙醇含量不能超过20%，即相当于最终检测体系中的浓度不会超过10%。
c.(选做)乙酰辅酶A或过氧化氢的存在会对游离脂肪酸的检测产生干扰，如果样品中含有乙酰辅酶A或过氧化氢，须同时设置样品背景对照孔，具体设置方法同步骤3b，并在步骤3d时用相同体积的检测缓冲液代替酶混合物B。
d.各孔加入2µl酶混合物B，混匀，37ºC避光反应30分钟。
注：样品背景对照孔请用2µl检测缓冲液替代酶混合物B。
e.各孔加入游离脂肪酸检测工作液50µl，混匀，37ºC避光反应30分钟。
注：如果由于样品中游离脂肪酸含量偏低而导致吸光度偏低或荧光偏弱，可适当延长反应时间，例如反应60分钟或更长时间。
f.如果使用吸光度检测，测定A570；如果使用荧光检测，设置激发波长为560nm，发射波长为590nm进行荧光强度检测。
g.建立标准曲线，并计算样品中游离脂肪酸的浓度(A)，如果样品背景对照孔信号比较高，样品的信号值需要减去样品背景对照值。游离脂肪酸标准曲线可以参考图2，吸光度检测在10-100µM浓度范围内有良好的线性关系，荧光检测在1-100µM浓度范围内有良好的线性关系。游离脂肪酸浓度的计算公式如下：
C (μM)= A×n
注：A为步骤3g根据标准曲线确定的游离脂肪酸浓度(μM)；
n为步骤3b样品总稀释倍数。
以棕榈酸(Palmitic Acid)为例，可以根据其分子量256.4计算出质量浓度(μg/ml)= C × 0.2564。
参考文献：
1.Guerra BA, Otton R. Int Immunopharmacol. 2011. 11(12):2220-6.
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5.Nordenström J, Carpentier YA, Askanazi J, Robin AP, Elwyn DH, et al. Ann Surg. 1983. 198(6):725-35.
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