不同原核表达质粒的比较和选择以及标签、蛋白酶切位点和蛋白共表达的考虑

不同原核表达质粒的比较和选择以及标签、蛋白酶切位点和蛋白共表达的考虑碧云天提供的His标签、GST标签、多种蛋白酶切位点以及蛋白共表达的一系列原核表达质粒的特点和用途参考下表。

产品编号	产品名称	包装	推荐指数	特点和用途
D2902	pET-N-His-C-His	1μg	+++++	用于大肠杆菌IPTG诱导表达N端或C端含有His标签，或者N端和C端都含有His标签的目的蛋白。His标签的位置灵活。
D2905	pET-N-His-TEV	1μg	++++	用于大肠杆菌IPTG诱导表达N端含有His标签的目的蛋白，并且该His标签可通过TEV蛋白酶切除。
D2908	pET-N-His-Thrombin-C-His	1μg	++++	用于大肠杆菌IPTG诱导表达 N端或C端含有His标签，或者N端和C端都含有His标签的目的蛋白。His标签的位置灵活。其中N端的His标签可通过Thrombin蛋白酶切除。
D2911	pET-N-GST-Thrombin-C-His	1μg	++++	用于大肠杆菌IPTG诱导表达N端含有GST标签或C端含有His标签，或者N端含有GST标签同时C端含有His标签的目的蛋白。其中N端的GST标签可通过Thrombin酶切除去。双标签，便于通过两种方法进行纯化。
D2916	pET-N-GST-PreScission	1μg	+++++	用于大肠杆菌IPTG诱导表达N端含有GST标签的目的蛋白，并且该GST标签可通过PreScission酶切除。切除标签比较方便。
D2931	pET-Dual-N-GST	1μg	++++	用于大肠杆菌IPTG诱导共表达两个蛋白形成蛋白复合物，其中第一个克隆区表达N端含有GST标签的蛋白A，第二个克隆区表达没有标签的蛋白B。双蛋白共表达。
D2933	pET-Dual-N-GST-PreScission	1μg	+++++	用于大肠杆菌IPTG诱导共表达两个蛋白形成蛋白复合物，其中第一个克隆区表达N端含有GST标签的蛋白A，该GST标签可通过PreScission酶切除，第二个克隆区表达没有标签的蛋白B。双蛋白共表达，切除标签比较方便。

诱导表达系统的考虑:
上述所有原核表达载体均采用T7 promoter，都可以确保目的蛋白的高表达，并且都可以使用IPTG进行目的蛋白的诱导表达，能有效避免非诱导表达系统中一些目的蛋白表达后对于细菌的损害而导致目的蛋白表达效率降低的问题。IPTG诱导表达系统是目前蛋白表达系统中最为成熟也最为常用的系统。热诱导表达等也有使用，但相对于IPTG诱导表达系统而言，就少很多了。

蛋白标签的考虑：
在进行原核蛋白表达时，为方便目的蛋白的表达纯化，通常可以在蛋白的N端或C端添加His标签或GST标签，这样可以使用镍柱，例如BeyoGold™ His-tag Purification Resin (P2210/P2218/P2220)或His标签蛋白纯化试剂盒(P2226)，或者GST柱，例如BeyoGold™ GST-tag Purification Resin (P2251/P2253/P2255)或GST标签蛋白纯化试剂盒进行目的蛋白的纯化。His标签比较小，对于目的蛋白活性产生影响的可能性相对比较小，采用镍柱纯化又非常方便，因此很多情况下His标签会被优先考虑。GST标签相对比较大，但GST标签重组蛋白在大肠杆菌中表达时具有可溶性高，并且容易保持目的蛋白完整活性等优点。许多真核蛋白在大肠杆菌中是以包涵体的形式表达的，但当它们在大肠杆菌中与GST融合表达时，相当一部分可以实现可溶性表达，从而有利于后续的纯化。对于后续需要通过酶切去除标签的情况，选择GST标签应该更加合适一些，因为一方面蛋白的可溶性会更好，并且后续采用PreScission Protease (P2302/P2303)切除GST标签比切除His标签更加便捷。

蛋白酶切位点的考虑：
对于有些蛋白，添加的His标签或者GST标签不会影响其生物学活性；但对于有些蛋白，添加了标签后可能会影响其生物学活性。在有影响的情况下，一种方法是尝试更换不同的标签，或者把标签在N端和C端之间进行变换；另外一种方法是通过在标签和目的蛋白之间添加适当的蛋白酶酶切位点，从而在后续通过蛋白酶酶切来去除标签。可以考虑添加和使用的蛋白酶识别位点包括PreScission、TEV和Thrombin等的酶切位点，然后可以使用相应的蛋白酶把标签切除。在这些蛋白酶中，PreScission蛋白酶(PreScission Protease, P2302/P2303)是比较合适的在4℃低温进行酶切的，其它的蛋白酶通常需要在室温或更高温度进行酶切。为了更好地保护目的蛋白的活性，通常在4℃进行酶切会更好一些。采用碧云天的PreScission Protease (P2302/P2303)，特别适合用于GST标签的切除。因为碧云天的的PreScission Protease (P2302/P2303)本身含有GST标签，在GST柱上酶切目的蛋白时，带有GST标签的PreScission Protease也会被结合在GST柱上，酶切洗脱下来的就只有去除了标签的目的蛋白，这样就给目的蛋白的纯化带来了极大的便利。TEV Protease的最佳反应温度是30℃，但也可以在4℃酶切过夜。碧云天的TEV Protease (P2307/P2308)带有His标签，比较适合His标签蛋白的酶切。TEV Protease (P2307/P2308)酶切后，酶可以通过镍柱结合而去除。
需要使用PreScission酶切位点时，可以通过在设计引物时引入PreScission的酶切位点，或者直接选购已经包含了PreScission酶切位点的质粒pET-N-GST-PreScission(D2916)或pET-Dual-N-GST-PreScission (D2933)，同时选购PreScission Protease (P2302/P2303)。如果希望使用TEV或Thrombin进行酶切以去除标签，可以考虑直接选购包含了相应酶切位点的质粒pET-N-His-TEV (D2905)、pET-N-His-Thrombin-C-His (D2908)和pET-N-GST-Thrombin-C-His (D2911)。

蛋白共表达的考虑：
随着科学研究的逐渐深入，有时不仅仅需要表达纯化单个蛋白，而是需要表达和纯化2个蛋白的复合物。蛋白复合物的结够和功能的研究已经成为了蛋白质科学研究新的热点和潮流。碧云天专门研发了特别适合两个蛋白共表达以形成蛋白复合物的载体pET-Dual-N-GST (D2926)和 pET-Dual-N-GST-PreScission (D2927)。这两个质粒均在第一个克隆区表达带有GST标签的目的蛋白A并在第二个克隆区表达无标签的目的蛋白B。这两个载体的差别是前者适合自行通过引物设计引入自己希望使用的蛋白酶酶切位点，而后者已经包含了PreScission酶切位点，直接在多克隆位点插入目的片段即可，这样可以通过GST标签纯化蛋白复合物后，并且随后可以通过PreScission酶切除GST标签。