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多肽与蛋白> 酶及活性检测> 生化酶
TEV Protease (His-tag)
产品编号: P2307
产品包装:1000U
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价格:¥206.00元
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P2307 TEV Protease (His-tag) 1000U 206.00元
P2308 TEV Protease (His-tag) 10000U 1426.00元

TEV Protease(His-tag)是一种在大抽杆菌中重组表达的带His标签(6X His tag)的烟草蚀纹病毒(Tobacco Etch Virus, TEV)的半胱氨酸蛋白酶,能特异性地识别七肽序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly/Ser,并在Gln和Gly/Ser氨基酸残基之间进行酶切,常用于去除融合蛋白的Glutathione S-transferase (GST)、His或者其它标签的蛋白酶。
建议把GST或His等标签设计在融合蛋白的N端,并在GST或His等标签与目的蛋白之间设计加入TEV Protease专一性识别与酶切的上述七肽序列。这样在GST或His标签被酶切后,在目的蛋白的N端仅有一个额外的Gly/Ser氨基酸残基,从而最大限度地减少了对目的蛋白结构和功能的影响。构建含有TEV Protease专一性识别位点的目的蛋白表达质粒,可以考虑选购碧云天的质粒pET-N-His-TEV (D2905)
TEV Protease的最佳酶切温度是30℃,在29-34℃范围内均具有较高的酶活性,但当温度达到或高于高37℃时,其酶活性会急剧下降。在实际操作过程中,为尽量保留目的蛋白的结构和生物活性,建议在4℃用TEV Protease酶切过夜。TEV Protease在pH6.0-9.0范围内具有活性,而当pH小于或等于5时,会失去酶活性。
TEV Protease还有一个突出的优点是在400mM咪唑中仍有较高活力,因此对于很多用镍柱纯化的His标签目的蛋白,可直接将TEV Protease加入含高浓度咪唑的刚刚纯化的目的蛋白溶液中,在4℃边透析去除咪唑边进行酶切。当然也可以在透析后再用TEV Protease进行酶切以去除His标签。经过酶切的目的蛋白,溶液中带有His标签的本TEV Protease以及切除下来的His标签,都可以通过与镍柱结合而去除。His标签蛋白的纯化可以考虑选购碧云天的BeyoGold™ His-tag Purification Resin(耐还原螯合型) (P2210/P2218/P2220)His标签蛋白纯化试剂盒(耐还原螯合型)(P2226)以及碧云天的BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型) (P2233)His标签蛋白纯化试剂盒(耐变性剂型) (P2229S)
TEV Protease的酶活性不会被常见的丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibtor)如PMSF、AEBSF、bestatin、pepstatin、E-64、TLCK和EDTA所抑制。但靶向半胱氨酸(Cysteine)残基的蛋白酶抑制剂如NEM或IAA等,可以显著抑制TEV Protease的酶活力,因为天然的TEV Protease含有其维持酶活力所必需的Cys151。
碧云天TEV Protease (His-tag)比较适用于酶切带His标签的蛋白,因为酶切后没有完全酶切的His标签重组蛋白、切除下来的His标签以及TEV Protease (His-tag)都可以结合于镍柱而被除去,穿柱液中则含有所需的靶蛋白。
酶活性单位定义:30℃,pH8.0条件下反应1小时,能够切割3µg对照底物达85%以上所需的酶量为一个活性单位。
碧云天TEV Protease (His-tag)酶活性鉴定结果可参考图1。

图1.TEV Protease (His-tag)切割GST标签蛋白的效果图。含有TEV Protease识别位点的76kD GST标签蛋白与TEV Protease进行反应,底物的用量为3μg,酶的用量依次为0、0.1、0.25、0.5、0.67、1、2U,30°C在1X TEV Buffer中反应1小时后取样进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色。酶切产物大小为约50kD的目的蛋白和约26kD的GST标签。
TEV Protease分子量大小约28kDa,纯度:≥95%。
TEV Protease储存液组成为:25mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 5mM DTT, 50%(v/v)甘油, pH8.0。
10X TEV Buffer组成为:500mM Tris-HCl, 500mM NaCl, 5mM EDTA, 10mM DTT, pH8.0。
本产品一个包装含有1000单位的酶,可用于约3mg带有TEV Protease识别位点的融合蛋白的切割。
包装清单:

产品编号 产品名称 包装
P2307-1 TEV Protease (His-tag) (1U/µl) 1ml
P2307-2 10X TEV Buffer 2ml
说明书 1份

保存条件:
-20℃保存。
注意事项:
本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.由于不同标签蛋白具有不同的特性,所以在实际使用时,建议对酶和标签蛋白的比例进行适当优化,以下是一个简单的估计酶用量的实验方案。
a.按照下表设置酶切反应体系:

组分 体积(μl)
H2O X
10X TEV Buffer 5
标签蛋白(8μg) Y
TEV Protease (His-tag) (1U/μl) 0、1.5或2.5
总体积 50

注:如果标签蛋白浓度为2μg/μl,那么Y=8/2=4,即须使用4μl 2μg/μl的标签蛋白。
b.将反应混合物放置于30℃反应1、2、4或6小时。如果目的蛋白在30℃很不稳定,可以考虑4℃反应过夜(16小时左右)。正常情况下按照上述反应体系,无论30℃反应1小时还是4℃反应16小时实际测定发现都可以充分剪切并去除标签的。
c.取20μl样品进行SDS-PAGE电泳分析,确定反应所需的合适酶量和合适的反应时间。

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使用本产品的文献:
1. Ma Y,Li L,Tian H,Lu M,Megharaj M,He W
Appl Microbiol Biotechnol. 2019 Jan;103(2):747-760.
2. Ni W,Liu H,Wang P,Wang L,Sun X,Wang H,Zhao G,Zheng Z
Bioprocess Biosyst Eng. 2019 Mar;42(3):465-474.
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