造血干细胞（hematopoietic stem cells, HSCs）是体内造血系统维持的关键。生物体内HSCs在静息态和进入细胞周期的活化态之间动态转换，以满足造血需求。静息态HSCs为维持长期造血能力，表现为低代谢和蛋白质翻译受限。而活化态HSCs代谢增强、蛋白质合成加速，长期造血能力丢失。生物体内HSCs需要在两种状态之间取得平衡，以维持生命周期内造血的动态性和可持续性。由于能量代谢和蛋白质稳态失衡会导致HSCs长期造血能力丢失，因此很难实现HSCs大规模扩增，使其在血液系统疾病治疗应用中受限。而HSCs中能量代谢和蛋白质稳态调控的关系，以及HSCs如何维持自身两种状态的平衡，一直是叩待解决的问题。

2022年7月7日，中山大学赵萌团队在 Cell Stem Cell（IF:25.269）杂志上发表题为 Amino acid catabolism regulates hematopoietic stem cell proteostasis via a GCN2-eIF2a axis 的文章。该团队研究了造血干细胞中能量代谢和蛋白质稳态调控之间的相互关系，并发现代谢物烟酰胺核糖（NAD⁺ precursor nicotinamide riboside, NR）可以调控氨基酸分解代谢促进HSCs的蛋白质稳态维持保护长期造血能力，对促进HSCs的体外扩增和增强移植后HSCs的造血重建能力有重要临床意义。

主要结果解读

首先研究人员利用气相色谱-高分辨质谱（GC-HRMS）及同位素标记技术研究发现，与祖细胞和成熟造血细胞相比，HSCs具有高氨基酸分解代谢能力。研究人员进一步探究发现，静息态HSCs葡萄糖摄取较低，糖酵解水平较高，线粒体复合物I-V活性低，ATP产量较低，而NAD+/NADH水平较高，表明HSCs依靠糖酵解而不是线粒体OXPHOS来产生能量。

随后，研究人员对比了静息态HSCs和活化态HSCs 氨基酸分解代谢情况，发现活化态HSCs氨基酸摄取增加、蛋白质合成增加及蛋白毒性应激基因上调等。此外，研究人员发现活化态的HSCs三羧酸循环中间代谢产物增加、糖酵解减少、LDH活性降低、乳酸水平降低、细胞外酸化率（ECAR）降低及活性氧（ROS）水平增加等。表明活化态HSCs为了满足增殖所需的蛋白质和能量，降低了氨基酸分解代谢，增强了蛋白质合成和线粒体OXPHOS。

接下来，为了探索蛋白质翻译调控的分子机制，研究人员通过低细胞数western blot检测来评估氨基酸缺陷的经典传感器GCN2-eIF2α轴。发现激活的GCN2 (p-GCN2)和磷酸化的eIF2a (p-eIF2a)在长期-HSCs (LT-HSCs)和短期-HSCs (ST-HSCs)中高表达，但在祖细胞和成熟细胞中不表达，这表明激活的GCN2-eIF2α轴感知到静息态态HSCs中低氨基酸水平，从而限制其蛋白翻译。在5fu激活的HSCs中，GCN2-eIF2α通路在第14天被抑制，在第28天HSCs内稳态恢复时恢复到基础水平，而其他内质网(ER)应激通路在激活的HSCs中保持不变。此外，在5fu诱导的增殖过程中，HSCs(而非分化的造血细胞)的蛋白合成增加、蛋白毒性应激基因上和凋亡增加。

进一步，研究人员使用GCN2敲除小鼠来研究GCN2在HSCs两种状态中的作用。发现GCN2缺失抑制p-eIF2α导致5FU诱导活化的HSCs中蛋白合成速率增加、蛋白聚集物积累、蛋白平衡应激和凋亡。此外，使用raphin1(一种小分子eIF2α激动剂)可将体外培养的GCN2缺失的HSCs的蛋白毒性应激恢复到与新分离的造血干细胞相似的水平,且raphin1体外处理部分恢复了对照和GCN2缺失的HSCs的集落形成能力，表明GCN2-eIF2α轴在增殖条件下抑制HSCs蛋白毒性应激中的作用。此外，研究人员表发现GCN2缺失并不影响稳态造血干细胞的蛋白质合成速率，且缺失GCN2不会增加蛋白质稳态应激，也不会显著改变未经过5FU处理的HSCs的表型数量或静止状态。然而，与对照造血干细胞相比，在竞争性移植中，GCN2缺失的HSCs在所有三个细胞系中都表现出明显的重建能力下降。在纯化的GCN2敲低的HSCs中重复观察到了p-eIF2a的抑制，在受体中表现出比对照造血干细胞更低的重建能力，表明GCN2在调节造血干细胞功能方面具有细胞内在作用。通过代谢组学等方法分析，研究人员发现GCN2有助于控制蛋白合成，并限制src介导的AKT激活，从而控制OXPHOS，表明GCN2在维持HSC功能中发挥重要作用。

为了探索可能影响GCN2-eIF2α通路的代谢物，研究人员在体外培养的造血干细胞中进行了糖酵解相关代谢物筛选。发现NAD+前体NR显著激活GCN2-eIF2a通路，并将其恢复到与新分离的HSCs相似的水平。且经实验证实，NR处理维持了HSCs在增殖条件下的代谢稳态和蛋白稳态。研究人员还观察到，NR处理显著增加了内稳态和处理后第14天5fu诱导的造血干细胞增殖，并保持了静止，降低了线粒体活性和电位。此外，研究人员进行了系列移植实验，以量化NR处理后HSCs在稳态和5fu诱导增殖过程中的长期自我更新能力。研究人员发现，在一次、二次和第三次移植的16周观察中，接受8周NR治疗的小鼠的HSCs的重建水平明显高于对照组细胞。通过连续移植检测发现，NR治疗对5FU处理后的小鼠HSCs的有益影响也很明显。研究人员还发现，在三轮连续移植试验中，2周NR体外培养扩增的功能性造血干细胞持续静止，降低线粒体电位和凋亡，并增加长期干细胞功能。总之，实验数据表明，NR处理增强了HSCs的长期功能。且研究人员又通过实验证实了GCN2对NR处理增强HSCs功能至关重要。

结论

该研究揭示了HSCs内稳态和增殖过程中代谢改变和翻译控制之间的直接联系。证明了静息态HSCs具有高氨基酸分解代谢能力 ，从而降低细胞内氨基酸水平，通过GCN2-eIF2α轴抑制蛋白质合成。而活化态HSCs线粒体氧化磷酸化增强，氨基酸代谢降低，使GCN2-eIF2α轴失活导致蛋白质合成增加，并伴随蛋白质毒性应激。证实了GCN2-eIF2α轴是控制HSCs功能的关键调节因子。通过靶向GCN2-eIF2α轴调控蛋白稳态，如延长NR处理，是扩大造血干细胞并维持其长期功能的一种新策略。

使用产品

该研究使用了多款碧云天产品，包括ATP-Na2 (≥99%, Reagent grade)、ATP检测试剂盒、乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒、NAD+/NADH检测试剂盒（WST-8法）、增强型线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）等。

产品信息：

产品编号	产品名称	包装
ST1092	ATP-Na2 (≥99%, Reagent grade)	1g/5g/25g
S0026	ATP检测试剂盒	200次
C0017	乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒	100次/500次
S0175	NAD+/NADH检测试剂盒（WST-8法）	100次
C2003	增强型线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）	>100次