使用说明：
如下以最常见的大肠杆菌中表达纯化GST标签重组蛋白为例，说明本试剂盒的使用方法。在其它体系中表达时，请参考该表达体系的相关使用说明，并借鉴大肠杆菌中纯化GST标签重组蛋白的使用说明。
1. 大肠杆菌中GST标签重组蛋白的诱导表达：
如下以最常用的IPTG诱导表达系统给予说明，诱导表达条件的优化请参照所使用的诱导表达体系的详细说明。其它诱导表达系统请参考适当的使用说明进行。
a. 挑取表达GST标签重组蛋白的单克隆，接种到3ml或10-20ml含适当抗生素的LB培养液中，培养过夜。
b. 按照1:20的比例取培养过夜的菌液，接种到预热至37ºC并含适当抗生素的LB培养液中。例如取5ml培养过夜的菌液接种到100ml预热至37ºC并含适当抗生素的LB培养液中。具体的培养体积视需要纯化的蛋白量而定，初步的鉴定培养3-10ml即可；常规的表达纯化，通常可考虑培养100-200ml；制备型的纯化，培养体积可以达到1L或更大。如果希望取得更好的表达效果，建议按照1:100的比例接种过夜培养的菌液，但后续培养至相应的OD值需要更长的时间。
c. 37ºC常规培养约30-60min或更长时间，至菌液的OD600达到0.5-0.7，并且OD600最好接近0.6。
d. 加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养4-5小时。
注：可以在加入IPTG前取出少量菌液同样培养4-5小时后作为未诱导的对照，也可以在加入IPTG前直接取出少量菌液作为未诱导的对照。对于特定蛋白的诱导表达，最佳的IPTG浓度、诱导温度、和诱导时间需要通过实验确定。
e. 收集菌液至离心管中，4ºC 4,000×g离心20min或4ºC 15,000×g离心1min，弃上清，收集沉淀。随后即可进入细菌裂解步骤，也可以在-20ºC或-80ºC冻存备用。冷冻保存的菌体使用前需置于冰上解冻15min。
2. 10X GSH溶液和洗脱缓冲液的配制：
a. 10X GSH溶液的配制：把试剂盒提供的184mg GSH用6ml本试剂盒提供的洗脱缓冲液(需添加GSH)溶解并混匀，即为10X GSH溶液。配制好的10X GSH溶液-20ºC保存，至少一年有效。
b. 洗脱缓冲液的配制：按照9:1的比例混合适量洗脱缓冲液(需添加GSH)和10X GSH溶液，例如9ml洗脱缓冲液(需添加GSH)和1ml 10X GSH溶液混合，混合后的溶液即为洗脱缓冲液。由于GSH在溶液中容易被氧化而失效，洗脱缓冲液宜新鲜配制，配制好的洗脱缓冲液4ºC保存，两周内有效。
3. BeyoMag™ GST标签蛋白纯化琼脂糖磁珠(GST纯化琼脂糖磁珠)的准备：
a. 用移液器轻轻吹打重悬GST纯化琼脂糖磁珠，按照每2-3mg目标蛋白(分子量约为60kDa)需要使用1ml磁珠悬浊液的用量，取适量GST纯化琼脂糖磁珠至一洁净离心管中(FTUB015)，磁性分离去除上清；加入与原磁珠悬浊液等体积或适当更大体积的裂解缓冲液洗涤磁珠。
b. 用移液器轻轻吹打重悬GST纯化琼脂糖磁珠。置于磁力架(FMS012/FMS024)上分离10秒，去除上清。重复上述步骤两次。
注：为了减少磁珠的损耗，待溶液澄清后，盖紧离心管盖子，保持离心管仍在磁力架上，按住离心管上下翻转数次，使澄清的溶液洗涤离心管盖子上残留的磁珠，静置后使溶液变澄清。以下同。
c. 根据后续纯化分别选择加入与原磁珠悬浊液等体积的裂解缓冲液重悬琼脂糖磁珠，备用。
4. GST标签蛋白的小量纯化：
本方法常用于小量样品的快速分析和鉴定，为后续大量制备打下基础。
a. 接步骤1e，离心收集1ml菌液的细菌沉淀并弃上清，加入100µl裂解缓冲液，将细菌沉淀充分重悬于裂解缓冲液中，可进行轻微的vortex(尽量避免产生气泡)。
注：根据GST标签蛋白表达的丰度，菌液和裂解缓冲液的体积比可以在25:1-5:1范围内适当调整。表达丰度非常高时，每毫升菌液沉淀可以加入200μl裂解缓冲液；表达丰度非常低时，每毫升菌液沉淀可以加入40μl裂解缓冲液。相关溶液的配制方法附后。如有必要，在裂解细菌之前，可以在裂解液中添加适量的蛋白酶抑制剂混合物，例如碧云天的P1025/P1026蛋白酶抑制剂混合物(细菌抽提用, 100X)，或P1005/P1006蛋白酶抑制剂混合物(通用型, 100X)。
b. 加入溶菌酶至1mg/ml并轻轻混匀，尽量避免产生气泡，冰水浴或冰上放置30min。
注：溶菌酶可以用裂解缓冲液配制成100mg/ml的母液，临使用前加入。溶菌酶配制成母液后，可以适当分装后-20ºC保存。
c. 轻轻vortex数下，以充分裂解细菌，尽量避免产生气泡。
d. 4ºC离心(15,000×g, 10min)，取10µl上清留样作后续检测用，收集余下上清至一新的洁净离心管中。
注：本步骤及后续步骤收集的上清必须保持澄清，即不含任何不溶物。上清中如果混有不溶性杂质会严重影响后续纯化获得蛋白的纯度。
e. 加入磁珠与孵育。加入20µl步骤3c中混合均匀的GST纯化琼脂糖磁珠悬浊液，置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育20-30min。注：如果需要，可以在2-8ºC旋转混合2小时甚至过夜，以防止目标蛋白降解。推荐使用BeyoShaker™数字式翘板摇床(E6673)或BeyoVortex™基础型旋转混匀仪(E6800)。
f. 磁分离。孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，去除上清。注：可保留部分上清液，用于检测目的蛋白的结合效果。
g. 洗涤。加入100µl裂解缓冲液，用移液器轻轻吹打重悬GST纯化琼脂糖磁珠。置于磁力架上分离10秒，取20µl上清留样作后续检测用，其余上清弃去。共重复洗涤三次。
h. 洗脱。加入20µl洗脱缓冲液，轻轻翻转离心管数次，使磁珠悬浮孵育5min，磁性分离，收集洗脱缓冲液到新的离心管，即为纯化获得的GST标签蛋白。如果有必要，可以重复洗脱步骤一次，收集样品到新的离心管中，还可以得到一些GST标签蛋白。
5. GST标签蛋白的大量纯化：
本方法适用于较大量(例如菌液体积在50ml及以上)蛋白样品的纯化。
a. 接步骤1e，对于新鲜的或解冻的细菌沉淀，按照每克细菌沉淀湿重加入4ml (2-5ml均可)裂解液的比例加入裂解液，充分重悬菌体。如有必要，可以在裂解细菌之前，在裂解液中添加适量的蛋白酶抑制剂混合物，例如碧云天的P1025/P1026蛋白酶抑制剂混合物(细菌抽提用, 100X)，或P1005/P1006蛋白酶抑制剂混合物(通用型, 100X)。注：后续试剂用量均按照1克菌重和4ml裂解液用量进行。
b. 加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml并混匀，冰水浴或冰上放置30min。
注：溶菌酶可以用裂解缓冲液配制成100mg/ml的母液，临使用前加入。溶菌酶配制成母液后，可以适当分装后-20ºC保存。
c. 冰上超声裂解细菌。超声功率200-300W，每次超声处理10s，每次间隔10s，共超声处理6次。
注：具体超声处理的方式须根据特定型号的超声仪器自行摸索和优化。
d. (可选做)如果超声处理后裂解液非常粘稠，可以加入适量核酸酶，如RNase A至10µg/ml及DNase I至5µg/ml，或BeyoZonase™超级核酸酶(≥99%) (D7121)，冰上放置10-30min，以降解核酸。或者也可以使用适当的装好了较细针头的注射器，反复抽吸数次，以剪切粘稠的基因组DNA等。
e. 4ºC 10,000×g离心20-30min，收集细菌裂解液上清并置于冰水浴或冰上。可以取20µl上清留作后续检测用。
注：上清必须保持澄清，即不含任何不溶物，才能进行下一步的纯化。上清中如果混有不溶性杂质会严重影响后续纯化获得蛋白的纯度。
f. 加入磁珠与孵育。加入1ml步骤3c中混合均匀的GST纯化琼脂糖磁珠，置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育20-30分钟。注：如果需要，可以在2-8ºC旋转混合2小时甚至过夜，以防止目标蛋白降解。推荐使用BeyoShaker™数字式翘板摇床(E6673)或BeyoVortex™基础型旋转混匀仪(E6800)。
g. 磁分离。孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，去除上清。注：可保留部分上清液，用于检测目的蛋白的结合效果。
h. 洗涤。洗涤磁珠5次，每次加入0.5-1ml裂解缓冲液，每次均收集约20µl穿柱的裂解缓冲液用于后续的分析检测用。洗涤及下一步洗脱过程中可以用Bradford法(P0006或P0006C)简单快速地检测每次裂解缓冲液液和洗脱缓冲液中的蛋白含量，从而考虑增加或减少洗涤和洗脱的次数。
注：如果出现后续获得蛋白纯度不够高的情况，可以再增加洗涤次数2-3次。
i. 洗脱。洗脱目的蛋白6-10次，每次用0.5ml洗脱缓冲液洗脱。将每次的洗脱缓冲液分别收集到不同的离心管中。收集获得的洗脱缓冲液即为纯化的GST标签蛋白样品。
常见问题：
1. 裂解液中目的蛋白含量过低。
a. 目的蛋白表达在包涵体中。
需调整表达条件(如降低蛋白表达的温度和使用较低浓度的IPTG进行蛋白的诱导)，使目的蛋白至少部分实现可溶性表达或使用变性剂溶解包涵体后复性，然后再进行纯化。
b. 培养条件不正确。
在同样的蛋白表达条件下，使用目的蛋白克隆时使用的含GST标签的空载体(例如碧云天的D2916 pET-N-GST-PreScission、D2911 pET-N-GST-Thrombin-C-His、D2926 pT7Duet-N-GST或D2927 pT7Duet-N-GST-PreScission)进行GST表达，观察其表达是否正常。
c. 诱导表达的蛋白迅速降解。
设置不同的诱导表达时间，摸索细菌培养、蛋白表达和降解的时间，最终选择适当的诱导时间。若蛋白是在细菌裂解后降解，则需加入蛋白酶抑制剂。另外，在蛋白纯化的所有步骤中，须严格保持在4ºC左右，以尽量减缓蛋白降解。
2. 表达的GST标签蛋白不与GST纯化琼脂糖磁珠结合。
a. 超声导致融合蛋白变性。
超声强度过高会导致融合蛋白变性，从而不能很好地与GST纯化琼脂糖磁珠结合。此时宜使用温和的超声条件，并且超声过程必须在冰浴中进行。另外也可以考虑采用非超声的裂解条件。
b. 目的蛋白由于还原性不足，导致空间构象异常。
在裂解前向裂解缓冲液中加入DTT至终浓度1-10mM，这样能显著改善某些蛋白的空间结构，从而有效改善某些GST标签蛋白与GST纯化琼脂糖磁珠的结合。
c. 检测空载体表达的GST与GST纯化琼脂糖磁珠的结合能力，以确定纯化体系能否正常工作。 表达GST的细菌裂解后，用GST纯化琼脂糖磁珠纯化其中的GST。如果空载体表达的GST能被GST纯化琼脂糖磁珠很好地纯化，说明纯化体系是可以正常工作的。融合蛋白可能改变了GST的构象或遮蔽了GST，从而抑制了其与GST纯化琼脂糖磁珠的结合。可以尝试将蛋白结合温度降低至4ºC并减少洗磁珠的次数来改善，有些蛋白同2b中提到的加入适量的DTT也有可能改善纯化效果。
d. 使用平衡好的GST纯化琼脂糖磁珠用于GST标签蛋白的纯化。
GST标签蛋白与GST纯化琼脂糖磁珠的结合在pH6.0以下或pH8.0以上会显著下降。在将蛋白裂解液与GST纯化琼脂糖磁珠结合前，请用裂解缓冲液充分平衡。
e. 使用未使用过的GST纯化琼脂糖磁珠。
如果GST纯化琼脂糖磁珠已被多次使用，其与GST标签蛋白的结合能力可能有所下降。在发现GST标签蛋白不能有效结合的情况下，有必要使用未使用过的GST纯化琼脂糖磁珠，或将GST纯化琼脂糖磁珠再生后再尝试使用。
f. 延长蛋白样品与GST纯化琼脂糖磁珠孵育时间。
影响GST标签蛋白与纯化介质结合的一个非常重要的参数是孵育时间，GST标签蛋白与GSH的结合速度相对较慢，因此在样品与磁珠孵育时间保持较长对于GST标签蛋白的充分结合非常重要。
3. GST标签蛋白不能被有效洗脱。
a. 使用新鲜配制的洗脱缓冲液。
b. 增加洗脱时间以改善洗脱效果。
c. 增加洗脱缓冲液的用量。
d. 增加洗脱缓冲液中GSH的浓度。
洗脱缓冲液中含有的10mM GSH在大多数情况下是足够进行洗脱的，但也存在洗脱不完全的特殊情况。对于这种情况，可以将洗脱缓冲液中的GSH浓度提高至20-50mM。
e. 提高洗脱缓冲液的pH。
较低的pH会影响洗脱效率。在洗脱效率较低时，可以尝试提高洗脱缓冲液的pH至8-9。
f. 增加洗脱缓冲液中的离子强度。
离子间相互作用可能会将蛋白留在磁珠上，增加洗脱缓冲液中的离子强度会改善这种状况。通常可以向洗脱缓冲液中加入0.1-0.2M NaCl。
g. 向洗脱缓冲液中加入非离子型去垢剂。
非特异的疏水作用可能会使蛋白沉淀，并阻止目的蛋白的洗脱。在此情况下，加入适当的去垢剂可能会有所改善。向洗脱缓冲液中加入Triton X-100至终浓度为0.1%或N-octylglucoside至终浓度为2%，都能够显著改善某些GST标签蛋白的洗脱。
4. 纯化获得的GST标签蛋白经SDS-PAGE电泳/Western blot检测有多条条带。
a. 洗涤条件错误或洗涤不充分。检查纯化过程中是否严格按照说明书的建议进行了充分的洗涤。
b. 70kD蛋白与GST标签蛋白共纯化。
70kD蛋白可能是大肠杆菌dnaK基因的表达产物，该蛋白参与大肠杆菌的蛋白折叠过程。据报道它们之间的这种结合可以通过在上GST纯化琼脂糖磁珠前，将GST标签蛋白在含有ATP的缓冲液(50mM Tris-HCl, 2mM ATP, 10mM MgSO4, pH7.4)中37ºC孵育10分钟而得以消除。也可以在洗涤时用上述含有ATP的缓冲液洗涤去除，或者后续通过离子交换柱等方法去除70kD蛋白。
c. 加入蛋白酶抑制剂。
多条条带有可能是由于GST标签蛋白的部分降解产生的。向裂解液中加入适当的蛋白酶抑制剂有时会有所改善。
注：在使用Thrombin或factor Xa酶切GST标签蛋白时，溶液中的丝氨酸蛋白酶抑制剂前必须除去，否则会严重抑制酶切效果。Prescission Protease通常不被认为是典型的丝氨酸蛋白酶，并且对多种蛋白酶抑制剂不敏感。
d. 使用蛋白酶缺陷型菌株。
多条条带的出现可能是宿主细菌表达的蛋白酶对目的蛋白的酶切结果。如果是这种情况，需要使用蛋白酶缺陷型菌株(如BL21(ompT))进行表达。
e. 降低超声强度。
细胞破碎效果可以通过溶液的澄清度或显微镜下观察细菌形态来判断。超声前加入溶菌酶通常可以改善超声破碎效果。尽量注意避免超声过程中产生泡沫，因为这可能会导致GST标签蛋白的变性。过度超声可能会导致宿主蛋白的变性及与GST标签蛋白的共纯化。
f. 采用额外的纯化步骤。
非特异条带可能是与GST标签蛋白与各种分子伴侣的共纯化，因为它们参与大肠杆菌中新合成蛋白的正确折叠。这些蛋白包括但不限于DnaK(70kD)、DnaJ(37kD)、GrpE(40kD)、GroEL(57kD)和GroES(10kD)。这种情况下，可以考虑采用额外的其它方法进一步纯化目的蛋白。
g. 抗GST的抗体中检测GST标签蛋白出现很多杂带时可能识别大肠杆菌的某些蛋白。
所使用的抗GST抗体可能能够与大肠杆菌某些蛋白结合，从而导致Western检测时出现杂带，选择经过大肠杆菌蛋白吸附过的抗GST抗体，就能很好地减少甚至消除这些杂带。

Problem	Possible Causes	Solution
Very few or no GST-tagged protein exists in the eluate.	Protein is not completely eluted.	1. Increase the GSH concentration to 15mM or higher in the elution buffer. 2. Increase the elution or incubation time. 3. Add Triton X-100 (0.1%) or n-Octylglucoside (2%) or NaCl (0.1-0.2M) to the Elution Buffer.
	No target protein expressed.	Make sure the protein of interest contains the GST-tag by Western blot or dot blot analyses.
	Very low protein expression level.	1. Use larger volume of cell lysate. 2. Optimize expression conditions to raise the protein expression level.
	Washes are too stringent.	Reduce the time and number of washes.
	Incubation times are inadequate.	Increase the incubation time.
	Detection system is inadequate.	If Western blot detection is used: 1. Check primary and secondary antibodies using proper controls to confirm binding and reactivity. 2. Verify that the transfer was adequate by using pre-stained protein marker or staining the membrane with Ponceau S. 3. Use fresh detection substrate or try a different detection system.
The purity of the target protein is low.	The target protein has degraded.	Add appropriate protease inhibitors such as PMSF to the cell lysate and Binding/Wash Buffer.
	Host proteins, such as chaperonins, may interact with the fusion protein	1. Add DTT (5mM) in the Binding/Wash Buffer. 2. Add Chaperonin Buffer (2mM ATP, 10mM MgSO4, 50mM Tris-HCl) to the cell lysate and incubate at 37ºC for 10 minutes prior to the purification.
	Washes are insufficient.	1. Increase the number of washes. 2. Prolong duration of the washes, incubating each wash for at least 15 minutes. 3. Add more stringent wash conditions. Detergent such as 1% Triton X-100, 1% Tween-20, 0.03% SDS, or 0.1% NP-40 may be used. 4. Centrifuge at lower speed to avoid nonspecific trapping of denatured proteins.
The binding capacity of the magnetic beads has declined.	Protein or other substances have aggregated on the beads.	Wash the beads with NaOH.
	The beads have been reused too many times.	Use new beads.

参考文献：
1. Einarson MB, Pugacheva EN, Orlinick JR. CSH Protoc. 2007. 2007:pdb.prot4757.
2. Schäfer F, Seip N, Maertens B, Block H, Kubicek J. Methods Enzymol. 2015. 559:127-39.
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产品编号	产品名称	包装
P2138-0.5ml	BeyoMag™ Anti-GST Magnetic Beads (Anti-GST磁珠)	0.5ml
P2138-2ml	BeyoMag™ Anti-GST Magnetic Beads (Anti-GST磁珠)	2ml
P2250	BeyoGold™ GST-tag Purification Resin	1ml
P2251	BeyoGold™ GST-tag Purification Resin	10ml
P2253	BeyoGold™ GST-tag Purification Resin	100ml
P2255	BeyoGold™ GST-tag Purification Resin	1000ml
P2258-2ml	BeyoMag™ GST标签蛋白纯化琼脂糖磁珠	2ml
P2258-10ml	BeyoMag™ GST标签蛋白纯化琼脂糖磁珠	10ml
P2258-50ml	BeyoMag™ GST标签蛋白纯化琼脂糖磁珠	50ml
P2260S	GST标签蛋白纯化试剂盒(琼脂糖磁珠法)	10ml
P2262	GST标签蛋白纯化试剂盒	10ml
FMS004	BeyoMag™磁分离架(4孔, 1.5ml/2ml, 蓝)	1个/盒
FMS008	BeyoMag™磁分离架(8孔, 1.5ml/2ml, 蓝)	1个/盒
FMS009	BeyoMag™磁分离架(8孔, 1.5ml/2ml, 铝合金)	1个/盒
FMS012	BeyoMag™磁分离架(12孔)	1个/袋
FMS015	BeyoMag™磁分离架(16孔, 1.5ml/2ml, 铝合金)	1个/盒
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FMS017	BeyoMag™磁分离架(16孔, 0.2ml/PCR管, 蓝)	1个/盒
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