使用说明：
1. 293悬浮细胞的复苏。
a. 将细胞冻存管从液氮或超低温冰箱中取出，并在37ºC水浴锅中迅速完全融化(保持冻存管的盖子在液面以上以防止污染)，并适当轻轻摇晃促融，切勿vortex。快速、完全融化可以提高细胞的复苏效果。
b. 打开冻存管前用70%酒精擦拭细胞冻存管外壁，注意某些记号笔不耐酒精，小心标注的记号被擦拭掉，推荐使用碧云天LAB MARKER (耐酒精记号笔, 黑色, 0.4/1.0mm) (
FPP21)。
c. 将完全融化的细胞直接离心，或者转移至无菌1.5ml或其它合适无菌离心管中，200×g室温离心5分钟，吸除上清，注意不要吸走细胞沉淀。
d. 用新鲜、预热至37ºC的增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)重悬后转移至培养容器中，推荐碧云天的BeyoGold™透气盖三角摇瓶系列产品，混匀，置于37ºC、5-8% CO
2、湿度80%的细胞培养摇床中培养，设置转速为130rpm (振幅26mm)。注：如摇床振幅为50mm，设置转速为120rpm。
2. 293悬浮细胞的传代。
a. 取处于对数生长期、细胞存活率大于95%、活细胞密度达到2-4×10
6个/ml以上的293细胞进行传代。
注1：不同类型的293细胞可能具有不同的对数生长期范围。
注2：在细胞传代30次或者持续3个月以上时，推荐复苏新的冻存细胞进行传代。
注3：推荐使用碧云天生产的台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒(
C0011)或细胞计数仪进行细胞存活率检测。
b. 将适量细胞悬液转移到无菌离心管内，200×g室温离心5分钟，弃去上清，加入适量预热的增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)，用吸管小心吹散沉淀细胞，获取细胞悬液。
c. 将细胞悬液以3×10
5-6×10
5个/ml的密度接种到新的培养容器中，培养条件与细胞复苏培养条件保持一致。
注1：每2-3天用增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)按上述步骤进行传代。
注2：为减少液体摇动产生的机械剪切力对细胞的损伤，装载大体积三角细胞摇瓶的摇床转速应适当调低。
注3：293悬浮细胞可能形成由2-10个细胞组成的细胞团，传代时可能需要剧烈涡旋细胞悬液40秒或适当时间，直到细胞团分散为单细胞悬液。
注4：请勿使用过高密度的细胞进行常规传代培养。
3. 293悬浮细胞的驯化。
a. 直接驯化法：
大部分情况下，培养于其它品牌无血清培养液中的293细胞，可以直接适应本增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)的培养，只需参照步骤2进行细胞传代即可。
b. 梯度驯化法：
梯度驯化法又称渐进式驯化或适应性驯化。由于增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)为化学成分限定培养液，有些293细胞需要进行梯度驯化，即在一段时间内用本增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)和原培养液的混合液培养细胞，培养过程中需逐渐降低原培养液占比、提升增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)占比。
(a) 用原培养液复苏293细胞，并使用该培养液继续培养2-3代直至293悬浮细胞稳定生长。
注：应选用低代数、处于对数生长期的细胞进行驯化。
(b) 参照下表对细胞进行梯度驯化。
| 增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)占比(%) |
原培养液占比(%) |
细胞接种密度(个/ml) |
细胞生长状态检测指标 |
进行下一阶段的标准 |
| 0 |
100% |
- |
VCD* & Cell viability |
VCD ≥ 3×106 cells/ml;
Cell viability ≥ 95% |
| 30% |
70% |
0.6×106 |
VCD & Cell viability |
VCD ≥ 2×106 cells/ml;
Cell viability ≥ 90% |
| 70% |
30% |
0.5×106 |
VCD & Cell viability |
VCD ≥ 2×106 cells/ml;
Cell viability≥ 90% |
| 100% |
0% |
0.4×106 |
VCD & Cell viability |
VCD ≥ 2×106 cells/ml;
Cell viability ≥ 90% |
* VCD, Viable cell density.
注1：每阶段应至少传代2次。
注2：在完全使用增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)接种3-4天之后，若VCD ≥ 3×10
6 cells/ml，Cell viability≥95%，则表明细胞生长、状态良好，该细胞已经完全驯化至适应增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)。
4. 293悬浮细胞的冻存。
a. 细胞的准备：使用对数生长期且细胞活率大于95%的细胞用于冻存。
注：须保存适量的已经培养过的培养液上清即条件培养液(Conditioned media)用于细胞冻存液的配制。
b. 进行细胞计数，确定活细胞密度，并计算活细胞密度为0.5-1×10
7个/ml时所需细胞冻存液的体积。
c. 细胞冻存液的配制：45%新鲜的增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)+45%条件培养液+10% DMSO，并在4ºC避光条件下预冷。配制的细胞冻存液须当天使用。为方便起见，推荐使用碧云天的BeyoAOF™无血清细胞冻存液(
C0210B)，可以直接使用无须进行配制。
d. 将细胞室温200×g离心5分钟，除去上清，用预冷的细胞冻存液将离心收集的细胞重悬。
e. 后续操作和普通细胞冻存一致，具体参考BeyoAOF™无血清细胞冻存液(
C0210B)中的使用说明。
注：建议细胞冻存24小时之后，或者长期冻存(例如半年或一年后)，进行细胞复苏，检测细胞复苏的效果。
5. 293悬浮细胞的瞬时转染。
a. 下表转染条件仅供参考，用户可根据实验的具体情况进行优化。此处以瞬时转染1L 293悬浮细胞为例：
| Items |
Value |
| VCD |
2-4×106 cells/ml |
| DNA |
0.7-2μg/ml |
| DNA/PEI ratio |
1:2~1:6 |
注：推荐使用碧云天专门适用于悬浮293细胞转染的Lipo293F™转染试剂(
C0518/
C0519)或线性聚乙烯亚胺(Polyethylenimine, Linear) (
C0537/
C0541)，使用方法也同样可以参考。
b. 取处于对数生长期、细胞存活率>95%、活细胞密度为2-4×10
6个/ml的293悬浮细胞进行转染。
c. 用10ml增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)稀释0.7-2mg质粒DNA，轻轻混匀。
d. 用10ml增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)稀释适量PEI，轻轻混匀。
e. 将PEI稀释液加到质粒DNA稀释液中，轻轻颠倒4-5次以充分混匀，室温孵育15-20分钟。
注：PEI稀释液与质粒DNA稀释液的混合顺序不可颠倒。
f. 将混合物逐滴加入细胞中，在加入过程中轻轻摇动三角细胞摇瓶。
g. 将细胞置于细胞培养摇床中培养，培养条件与细胞正常培养条件保持一致。
h. 一般本增强型293无血清培养液(含L-谷氨酰胺)可维持48-72小时的培养时间，无须添加补料；也可以在转染后每隔24小时向细胞中添加一定量的补料，在加入过程中轻轻摇动培养容器。随后将细胞放回细胞培养摇床中继续培养。
i. 当细胞存活率<80%时收集细胞上清液或细胞进行后续纯化。
参考文献：
1. Schneider MD, French BA. Circulation. 1993. 88(4 Pt 1):1937-42.
2. Fisher KJ, Jooss K, Alston J, Yang Y, Haecker SE, et al. Nat Med. 1997. 3(3):306-12.
3. Yan SB, Chao YB, van Halbeek H. Glycobiology. 1993. 3(6):597-608.
4. Graham FL, Smiley J, Russell WC, Nairn R. J Gen Virol. 1977. 36(1):59-74.
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