使用说明：
1.细胞样品的准备。
根据细胞的大小和生长速度将适量细胞接种到96孔等多孔细胞培养孔板中，使待检测时细胞密度不超过80-90%满为宜。同时设置不含细胞的培养液孔作为背景对照，按照细胞培养的常规方法培养细胞。如有需要，可加入不同药物进行处理，并设置适当对照。药物刺激完毕后，直接取细胞培养上清或将细胞培养板用多孔板离心机400×g离心5分钟，所得上清即为待测样品。
注：在进行药物处理时，须在背景对照等对照孔中加入对应的药物溶剂以排除药物溶剂对实验的干扰。
2.试剂盒的准备。
a.融解LDH Release Assay Buffer，平衡至室温后混匀备用。其它试剂存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
b.LDH检测工作液(LDH Assay Working Solution)的配制：按照每个检测反应100µl的体积配制适量的LDH检测工作液。均匀混合91μl LDH Release Assay Buffer和9μl Chromogen Solution，即可配制成100µl LDH检测工作液。根据待检测样品(包括对照)的数量，配制适量的LDH检测工作液，具体配制方法参考下表。配制好的LDH检测工作液可以4ºC避光保存1天，现配现用效果更佳。配制和使用过程中均要注意适当避光。
| Samples |
1 |
10 |
20 |
50 |
| LDH Release Assay Buffer |
91μl |
910μl |
1820μl |
4550μl |
| Chromogen Solution |
9μl |
90μl |
180μl |
450μl |
| LDH Assay Working Solution |
100μl |
1ml |
2ml |
5ml |
3.标准曲线与样品的检测。
a.LDH标准曲线的设置。
取12μl Lactate Dehydrogenase (2.5U/ml)，加入588μl LDH Release Assay Buffer，混匀，配制成50mU/ml乳酸脱氢酶标准溶液。分别取50mU/ml的乳酸脱氢酶标准溶液0、5、10、20、40、60、80、100μl加入96孔板的标准品孔中，并用LDH Release Assay Buffer补足至100μl，此时，标准曲线各孔的LDH浓度分别为0、2.5、5、10、20、30、40、50mU/ml，LDH量分别为0、0.25、0.5、1、2、3、4、5mU。
注：初次检测，可以按照以上浓度设置标准曲线。在后续的实验中，可以根据样品中LDH的活性对标准曲线的浓度范围进行适当调整。
b.取1-100μl样品或稀释后的样品加入96孔板样品孔中，并加入LDH Release Assay Buffer至样品孔中，补足至100µl。
注：为确保样品数值在标准曲线范围内，建议进行预实验将样品设置多个稀释倍数，以确定样品中LDH的大致活性，如果数值不在标准曲线范围内，请调整样品的稀释倍数或者样品的量。样品总稀释倍数记为n (例如本步骤中对样品进行了10倍稀释，加入的“稀释后的样品”为50µl，则n=10×100/50=20)。
c.标准品孔和样品孔各孔加入100μl LDH检测工作液，混匀，37℃避光孵育10-30分钟。孵育时可用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动。推荐使用BeyoShaker™数字式翘板摇床(
E6673)。
d.在每个孔中加入20μl Stop Solution，混匀，然后在450nm处测定吸光度。如无450nm滤光片，可以使用420-480nm的滤光片。可以选择设定600nm (或600nm以上，如650nm)作为参比波长(也称参考波长)，450nm吸光度的读数扣除参比波长的吸光度读数即可作为实测读数(A450)。
注：为确保检测效果，可以不添加终止液，在不同时间点测定吸光度，直到获得比较理想的吸光度数据为止，然后再酌情添加Stop Solution。
e.建立LDH标准曲线，并计算样品中释放的乳酸脱氢酶活性。如果样品背景对照孔的信号比较高，样品的信号值应减去样品背景对照的信号值。LDH标准曲线可以参考图2，在0.15-50mU/ml范围内有良好的线性关系。Released LDH Activity的计算公式如下：
Released LDH Activity (mU/ml)=B×n
注1：B为步骤3e根据标准曲线确定的LDH活性(mU/ml)；
n为步骤3b中样品总稀释倍数。
注2：对于LDH酶活性的检测，也可以使用碧云天的乳酸脱氢酶检测试剂盒(WST-8法) (
P0392/
P0393/
P0395)，可分别检测D-LDH、L-LDH和总LDH。
参考文献：
1.Markert CL. Cell Biochem Funct. 1984. 2(3):131-4.
2.Feng Y, Xiong Y, Qiao T, Li X, Jia L, et al. Cancer Med. 2018. 7(12):6124-6136.
3.Broussas M, Broyer L, Goetsch L. Methods Mol Biol. 2013. 988:305-17.
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