使用说明：
1. 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)：
a. 蛋白样品的准备：
(a) 对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次，然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。可以使用碧云天生产的
Western及IP细胞裂解液(P0013)或各种RIPA裂解液(
P0013B、
P0013C、
P0013D或
P0013E)等进行细胞的裂解。
(b) 对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。
(c) 对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。
注：详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材，参考10厘米培养皿的裂解液的用量进行裂解。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。
b. 去除非特异性结合
(可选做)：
(a) 取200微升至1毫升蛋白样品，蛋白量约为200微克至1毫克，加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的Protein G Agarose，4℃缓慢摇动30分钟至2小时。
(b) 2500rpm(约1000g)离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。
注：所谓种属相同的IgG是指，例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG，如无normal IgG，可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。通过和normal IgG和Protein G Agarose的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。
c. 免疫沉淀：
(a) 加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动过夜。
(b) 再加入20微升充分重悬的Protein G Agarose，4℃缓慢摇动1-3个小时(为方便后续的洗涤操作，可以把加入充分重悬的Protein G Agarose的量调整为40微升)。
(c) 2500rpm(约1000g)离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein G Agarose。
(d) 用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤(c)。
(e) 完成最后一次洗涤后，去除上清，加入20-40微升1X SDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀，瞬时高速离心把样品离心至管底。
(f) 100℃或沸水浴处理3-5分钟，取部分或全部样品用于SDS-PAGE电泳，暂时不用的样品可以-20℃保存。
2. 免疫共沉淀：
参考免疫沉淀的方法进行，但免疫共沉淀(Co-IP)通常必须使用未经冻存的新鲜蛋白样品。普通的免疫沉淀虽然可以使用冻存的蛋白样品，但也宜用新鲜的蛋白样品为佳。
3. 抗体纯化：
a. 准备工作：
(a) 用0.45微米或0.2微米孔径的滤膜过滤所用的溶液。
(b) 所有的溶液必须用超声等方法脱气(degas)。
(c) 选择适当的纯化柱，用适当量的Protein G Agarose装填纯化柱。也可使用碧云天的预装柱产品(
P2026、
P2027)。
(d) 用10-20倍柱体积的TBS洗涤并平衡纯化柱，流速可以用恒流泵控制为1ml/min (1ml预装柱)。如无恒流泵，也可以完全依靠重力洗涤并平衡纯化柱。
b. 抗体纯化：
(a) 把含有待纯化的抗体上样到纯化柱。
(b) 待纯化的抗体过柱后，用10-20倍柱体积的TBS洗涤，以去除未结合和非特异性结合的蛋白。洗涤是否完全可以通过测定280nm的吸光度进行确定。
(c) 洗涤完后，用5-10倍柱体积的50mM glycine，pH2.7作为洗脱液，洗脱结合的抗体。某些抗体和Protein G的结合能力很强，在pH2.7时洗脱效果不太理想，可以使用50mM glycine，pH1.9作为洗脱液。分管收集洗脱下的抗体，根据蛋白浓度或后续的检测效果确定洗脱峰在哪几个收集管中。
c. 纯化柱的再生：
(a) 用10-20倍柱体积的TBS洗涤纯化柱，使纯化柱达到中性的pH。
(b) 用TBS来保存再生的纯化柱。
相关产品：
| 产品编号 |
产品名称 |
包装 |
| P2006 |
Protein A Agarose (Fast Flow, 进口分装) |
2ml |
| P2009 |
Protein G Agarose (Fast Flow, 进口分装) |
2ml |
| P2012 |
Protein A+G Agarose (Fast Flow, 进口分装) |
2ml |
| P2015 |
Protein A Agarose (Fast Flow, 抗体纯化用) |
2ml/10ml/50ml/200ml |
| P2017 |
Protein G Agarose (Fast Flow, 抗体纯化用) |
2ml/10ml/50ml/200ml |
| P2019 |
Protein A+G Agarose (Fast Flow, 抗体纯化用) |
2ml/10ml/50ml/200ml |
| P2024 |
Protein A Agarose (Fast Flow, 1ml)预装柱 |
1个 |
| P2025 |
Protein A Agarose (Fast Flow, 5ml)预装柱 |
1个 |
| P2026 |
Protein G Agarose (Fast Flow, 1ml)预装柱 |
1个 |
| P2027 |
Protein G Agarose (Fast Flow, 5ml)预装柱 |
1个 |
| P2028 |
Protein A+G Agarose (Fast Flow, 1ml)预装柱 |
1个 |
| P2029 |
Protein A+G Agarose (Fast Flow, 5ml)预装柱 |
1个 |
| P2051 |
Protein A Agarose (Fast Flow, for IP) |
2ml/10ml/50ml |
| P2053 |
Protein G Agarose (Fast Flow, for IP) |
2ml/10ml/50ml |
| P2055 |
Protein A+G Agarose (Fast Flow, for IP) |
2ml/10ml/50ml |
| P2102 |
BeyoMag™ Protein A磁珠 |
1ml/5ml |
| P2103 |
BeyoMag™耐碱Protein A磁珠 |
1ml/5ml |
| P2105 |
BeyoMag™ Protein G磁珠 |
1ml/5ml |
| P2106 |
BeyoMag™ Protein G Plus磁珠 |
1ml/5ml |
| P2108 |
BeyoMag™ Protein A+G磁珠 |
1ml/5ml |
| P2163 |
耐碱Protein A Agarose (Fast Flow, 抗体纯化用) |
1ml/5ml/20ml |
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