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核酸相关> 菌种与质粒> 真核载体
pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB (RaPID阳性对照质粒)
产品编号: D3042-100μg
产品包装:100μg
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价格: ¥ 1169.00
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产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
D3042-1μg pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB (RaPID阳性对照质粒) 1μg 888.00元
D3042-100μg pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB (RaPID阳性对照质粒) 100μg 1169.00元

pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB (RaPID阳性对照质粒)是碧云天自行研发生产的RaPID质粒对中RNA诱饵载体(pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB) (D3040)的阳性对照质粒。EDEN15是一段富含UG的RNA序列,可以高效结合分子量大小约50kDa的CELF1 (CUGBP Elav-Like Family Member 1)。

RaPID (RNA-Protein Interaction Detection)是在活细胞内(in Vivo)以RNA为中心(RNA-centric),利用生物素连接酶对与RNA诱饵片段相互作用的蛋白质进行生物素标记,后续通过Streptavidin磁珠或凝胶从细胞裂解液中分离纯化生物素标记蛋白,并通过质谱(Mass spectrometry, MS)或Western鉴定RNA-蛋白质间相互作用的技术(图1)。RaPID在筛选和鉴定活细胞内非编码RNA序列(Noncoding RNA sequence):包括长链非编码RNA (Long noncoding RNA, lncRNA)、小核仁RNA (Small nucleolar RNA, snoRNA)和非翻译mRNA区域(Untranslated mRNA region),与RNA结合蛋白(RNA-binding protein, RBP)相互作用和探索相关功能方面发挥着至关重要的作用[1-3]。

图1. 碧云天RaPID (RNA-Protein Interaction Detection)生物素标记质粒的工作原理图[1]。

RaPID具有如下优点:①活细胞内标记:适合空间和时间上对细胞内究RNA-蛋白质间的相互作用动态过程的研究,如亚细胞定位、翻译后修饰或蛋白质浓度变化导致的影响,还可以提供动力学数据。②不需要交联:RaPID无需交联,传统的甲醛或紫外光照射交联不仅对细胞影响较大,而且交联效率较低。③敏感性高:RaPID可以有效识别RNA与蛋白之间微弱、短暂的相互作用。④所需细胞数目少:相比于常见的ChIRP (Chromatin Isolation by RNA Purification)技术需要1-5×108个细胞,RaPID只需要2-5×106个细胞。⑤适用RNA种类多:对RNA结构没有限定,具有二级结构和无特定结构均可,而且可以研究<50nt的小RNA片段。⑥反应速度快:加入生物素后,miniTurbo最快10分钟就可以完成对RNA结合蛋白的生物素标记。

RaPID包括2个质粒:RaPID生物素连接酶载体(pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag) (D3039),即RaPID protein;和RNA诱饵载体(pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB) (D3040),即RNA component。

pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag (D3039)可在哺乳动物细胞中融合表达λN肽段、核外运信号和生物素连接酶(miniTurbo):λN肽段(MNARTRRRERRAEKQAQWKAAN, 22aa)能够将miniTurbo定位结合到RNA诱饵片段旁的BoxB茎环结构上;核外运信号(Nuclear Export Signal, NES) 辅助miniTurbo进入细胞质中;miniTurbo是利用酵母表面展示(Yeast surface display)基于E.coli生物素连接酶(BirA)人工改造获得的新型生物素连接酶,在ATP存在的条件下,miniTurbo可以高效活化生物素(D-Biotin)形成生物素酰-5'腺苷酸(Biotinoyl-5'-AMP),对与其邻近的(~10nm)任意暴露在外的蛋白赖氨酸残基进行生物素标记,从而对与RNA诱饵片段相互作用的蛋白质进行生物素标记。

pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB (D3040)是碧云天自行研发生产的一种用于在哺乳动物细胞中表达RNA诱饵片段的载体,RNA诱饵片段被2个λ噬菌体(Bacteriophage lambda)的BoxB RNA茎环结构夹在中间,其中BoxB茎环结构与λN肽段具有极高的亲和力。

本质粒含有CMV启动子,可以高效启动EDEN15 RNA片段在细胞中的表达;可通过荧光显微镜观察细胞表达EGFP绿色荧光的情况,以确定在EGFP的3' UTR端EDEN15 RNA片段的表达情况;带有氨苄青霉素(Ampicillin)抗性和新霉素(Neomycin)抗性,可利用其氨苄青霉素抗性转化大肠杆菌后筛选阳性菌;转染哺乳动物细胞后,可使用G418 (ST081)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株,G418和新霉素效果一致,但G418的细胞毒性更低。

pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB质粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
CMV promoter 235-818
EGFP 907-1626
3X λ boxB right 1648-1706
EDEN15 1713-1757
3X λ boxB right 1765-1823
BGH poly(A) signal 1884-2108
f1 ori 2154-2582
SV40 promoter 2596-2925
Neomycin resistance gene 2992-3786
SV40 poly(A) signal 3960-4081
lac operator 4154-4170
CAP binding site 4223-4244
ori 4532-5117
Ampicillin resistance gene 5288-6148
Ampicillin promoter 6149-6253

pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB质粒(6284bp)的图谱如下:

pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB表达基因的详细图谱见说明书:https://www.beyotime.com/Manual/D3042 pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB (RaPID阳性对照质粒).pdf

pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB中没有的酶切位点包括:

AarI AbsI AccIII Acc65I AccB7I AcvI AfeI
AflII AgeI AjiI AjuI Aor13HI Aor51HI AscI
AsiGI AsiSI Asp718I AxyI BamHI BanIII BarI
BbrPI BbvCI BfrI BlpI BmgBI BoxI Bpu1102I
Bsa29I Bse21I BseAI BseCI BshVI BshTI BsiWI
Bsp13I Bsp1720I BspDI BspEI BspTI BspXI Bst98I
BstAFI BstEII BstHPI BstPI BstPAI BstXI Bsu15I
Bsu36I BsuTUI BtrI CciNI CelII Cfr42I ClaI
CspAI DraII Eco32I Eco47III Eco72I Eco81I Eco91I
EcoO65I EcoO109I EcoRV FseI FspAI HpaI I-CeuI
I-PpoI I-SceI KflI KpnI Kpn2I KspI KspAI
MauBI MreI MroI MspCI Nb.BbvCI NotI Nt.BbvCI
PacI PalAI PaqCI PasI Pfl23II PflMI PI-PspI
PI-SceI PinAI PmaCI PmlI PpuMI PshAI Psp5II
PspCI PspEI PspLI PspPPI PspXI PsrI RgaI
RigI SacII SanDI SbfI SdaI SfaAI SfiI
Sfr303I SgfI SgrAI SgrBI SgsI SmiI SrfI
Sse8387I SstII SwaI TstI Van91I Vha464I XbaI
XcmI

pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB中的单酶切位点包括:

AhdI ApaI AvrII BbsI BglII BmtI BsaBI
BsmI BsrGI BssHII BstBI BstZ17I CsiI DraIII
EagI Eco53kI KasI MfeI MluI MscI NarI
NdeI NheI NruI PaeR7I PciI PflFI PluTI
PmeI PspOMI PstI PvuI RsrII SacI ScaI
SexAI SfoI SgrDI SmaI SnaBI SpeI SspI
StuI TspMI Tth111I XhoI XmaI

pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB质粒中推荐使用的测序引物序列如下:

CMV-F (769-789): 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'

BGH-R (1895-1878): 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3'

pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB的全序列信息:D3042 pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB (RaPID阳性对照质粒)-全长序列.txt。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D3042-1µg pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB 1µg
D3042-100µg pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB 100µg
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1µg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.25µg/µl,共400µl。可以直接用于酶切或者转染细胞。
参考文献:
1.Ramanathan M, Majzoub K, Rao DS, Neela PH, Zarnegar BJ, et al. Nat Methods. 2018. 15(3):207-212.
2.Ramanathan M, Porter DF, Khavari PA. Nat Methods. 2019. 16(3):225-234.
3.Branon TC, Bosch JA, Sanchez AD, Udeshi ND, Svinkina T, et al. Nat Biotechnol. 2018. 36(9):880-887.
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D3023-100µg pCMV-C-BioID2-Flag (邻近蛋白生物素标记质粒) 100µg
D3025-1µg pCMV-BioID2-Flag (阴性对照质粒) 1µg
D3025-100µg pCMV-BioID2-Flag (阴性对照质粒) 100µg
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D3027-100µg pCMV-N-Flag-AirID (邻近蛋白生物素标记质粒) 100µg
D3029-1µg pCMV-C-AirID-Flag (邻近蛋白生物素标记质粒) 1µg
D3029-100µg pCMV-C-AirID-Flag (邻近蛋白生物素标记质粒) 100µg
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D3030-100µg pCMV-AirID-Flag (阴性对照质粒) 100µg
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D3040-100µg pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB (RaPID质粒) 100µg
D3042-1µg pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB (RaPID阳性对照质粒) 1µg
D3042-100µg pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB (RaPID阳性对照质粒) 100µg
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