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T7启动子载体系统如pET载体是目前应用最广泛的载体系统，具有非常快速高效的蛋白表达能力，可在短短几个小时内将目的蛋白水平提高到细胞总蛋白含量的50%左右。在蛋白表达纯化实验中，因对宿主有一定毒性而导致宿主生长困难甚至死亡的目的蛋白一般被称为毒性蛋白。而T7启动子载体系统对于毒性蛋白的表达往往不尽如人意。小编查阅各种资料发现，目前常用的两种解决思路有：1.提高宿主对毒性蛋白的耐受；2.严谨控制毒性蛋白的表达。现就这两种思路跟小编一起来了解下如何解决毒性蛋白原核表达吧~
思路一：提高宿主对毒性蛋白的耐受
BL21（DE3）是利用T7RNA聚合酶表达系统蛋白表达最常用的菌株，但在这种表达系统中蛋白质的过表达经常会受到细菌细胞死亡的限制或阻止。1996年，来自英国剑桥的Bruno Miroux和John E. Walker利用毒性蛋白oxoglutarate-malate carrier protein 筛选出了幸存下来的BL21（DE3）突变菌株——C41（DE3），并且证明该菌株能够不受该蛋白毒性影响生长到高饱和细胞密度。同样地思路，该研究团队使用另外一种毒性蛋白subunit b of bacterial F-ATPase在C41(DE3)的基础上筛选出了具有更强表达毒性蛋白和疏水蛋白能力的双重突变株——C43(DE3)。值得注意的是，使用这两种菌株表达蛋白的蛋白表达量均比BL21(DE3)菌株低。目前该两种菌株已广泛应用于毒性蛋白的表达。碧云天目前提供有在C43(DE3)基础上表达PLysS的（PLysS是什么？请继续往下看哦~）超级感受态细胞 (D1023) 供大家选购：
| 产品编号 | 产品名称 | 产品包装 |
| D1023S | C43(DE3)PLysS超级感受态细胞 | 10×100μl |
| D1023M | C43(DE3)PLysS超级感受态细胞 | 50×100μl |
思路二：严谨控制毒性蛋白的表达
由于毒性蛋白会造成宿主菌生长缓慢甚至死亡，并且有些毒性基因因为有本底表达导致基因克隆时发生基因突变而导致实验失败，因此可以通过严谨控制毒性蛋白的表达，待宿主细菌生长到一定密度后再诱导表达该蛋白从而获取具有毒性的目的蛋白。要达到这一目的，一般可从表达载体和宿主细菌两方面着手：
方法1——通过表达载体控制蛋白表达
最常使用的方法就是引入乳糖操纵子系统到T7表达载体内。无乳糖时，该操纵子被阻遏，Lac I基因表达产生阻遏物（repressor），阻遏物与操纵基因（operator）结合从而阻止RNA聚合酶转录lac基因，进而抑制位于lac下游的T7启动子的转录起始，从而抑制毒性蛋白在没有诱导情况下的背景表达对细菌生长的影响。在半乳糖类似物（如IPTG）的诱导下，IPTG与阻遏物结合，改变了阻遏物的构象，从而阻止了阻遏物与操纵基因结合，进而启动RNA聚合酶转录lac基因及其下游的T7启动子，实现毒性蛋白的表达。
碧云天新近上架的pT7-3lac-C-His (毒性蛋白原核表达质粒)是碧云天自行研发的一种适用于严谨控制目的蛋白本底性表达C端含有His标签(His-tag)的对于细菌有毒性的目的蛋白的原核表达质粒。本质粒含有T7启动子，在RBS位点的前面插入了3个乳糖操纵子lac，在多克隆位点的后面有一个His标签的编码序列，该His标签编码6个组氨酸(6X His)。在多克隆酶切位点之间按照读码框插入不带有终止密码子的目的基因，这样就可以表达C端带有His标签的目的蛋白，方便用户后续的蛋白纯化实验。当然用户也可以在多克隆位点插入N端带其它标签的蛋白，然后在蛋白的C端插入终止密码子。
图1. pT7-3lac-C-His质粒(5317bp)的图谱。
此外，碧云天还新研发上架了更加严谨地控制目的蛋白表达的pT7-rrnBT1-T2-2lac-C-His-Amp (毒性蛋白原核表达质粒)和pT7-rrnBT1-T2-2lac-C-His-Kana (毒性蛋白原核表达质粒)。这两款质粒，在T7启动子的前面插入了1个rrnB T1 terminator、1个rrnB T2 terminator和1个乳糖操纵子lac，在T7启动子的后面插入了2个乳糖操纵子lac；质粒中的rrnB T1 terminator和rrnB T2 terminator通过形成RNA依赖的发夹(hairpin)结构防止相关克隆基因在大肠杆菌的本底表达，特别适合一些对大肠杆菌有毒性的基因的克隆及表达对细菌生长的影响。
图2. pT7-rrnBT1-T2-2lac-C-His-Amp质粒(5743bp)的图谱。
图3. pT7-rrnBT1-T2-2lac-C-His-Kana质粒(5616bp)的图谱。
相关产品信息：
| 产品编号 | 产品名称 | 产品包装 |
| D5015 | pT7-3lac-C-His (毒性蛋白原核表达质粒) | 1μg/100μg |
| D5017 | pT7-rrnBT1-T2-2lac-C-His-Amp (毒性蛋白原核表达质粒) | 1μg/100μg |
| D5019 | pT7-rrnBT1-T2-2lac-C-His-Kana (毒性蛋白原核表达质粒) | 1μg/100μg |
方法2——通过宿主菌控制蛋白表达
噬菌体T7溶菌酶(T7 lysozyme)是一种天然的T7 RNA聚合酶抑制剂，它可以降低T7 RNA聚合酶诱导基因的基础活性，并在T7启动子的控制下在同一细胞中建立相对有毒的基因。T7溶菌酶延长了开始诱导到达最高表达量的时间，表达了足够量的T7 RNA聚合酶才能克服溶菌酶的抑制作用，从而启动目的基因的转录。pLysS、pLysL、pLysE和pLysH都带有T7溶菌酶编码基因，且与pET载体兼容。含有pLysS或pLysL的宿主细菌细胞表达低水平的溶菌酶，足以稳定许多靶质粒，并且在诱导T7 RNA聚合酶时可以产生高水平的靶蛋白；含有pLysE或pLysH的宿主细菌细胞表达高水平的溶菌酶，降低了T7 RNA聚合酶的完全诱导活性，从而使诱导细胞能够继续生长并无限地产生无害的靶蛋白。碧云天提供多款pLysS甘油菌及超级感受态可供大家选购哦：
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 | 产品价格 |
| D0339 | BL21(DE3)pLysS甘油菌(低本底蛋白诱导表达用) | 200μl | |
| D0341 | BL21 Star (DE3)pLysS甘油菌(低本底蛋白高诱导表达用) | 200μl | |
| D0345 | BL21-Gold(DE3)pLysS甘油菌(蛋白诱导表达兼质粒克隆菌株) | 200μl | |
| D1015 | BL21(DE3) PLysS超级感受态细胞 | 10×100μl/50×100μl | / |
| D1021 | BL21 Star (DE3)pLysS超级感受态细胞 | 10×100μl/50×100μl | / |
| D1023 | C43(DE3)PLysS超级感受态细胞 | 10×100μl/50×100μl | / |