其基本原理为：聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同分子量的蛋白质样品分离，分离后的蛋白被转移到固相支撑物（杂交膜）上，一抗特异性识别目标蛋白，通过HRP、AP、生物素、地高辛或者荧光探针等标记的二抗识别一抗，最终通过显色、荧光或者化学发光等方法将目标蛋白可视化，从而对目标蛋白进行定性和定量分析。

  一.      了解目标蛋白

首先要了解：样品是来自什么物种？目标蛋白定位在哪种组织或细胞器？是可溶蛋白还是不可溶蛋白？是高丰度蛋白还是低丰度蛋白？在制备时需要保持蛋白的天然活性，还是需要变性蛋白？

其次要知道：哪种方法或试剂能够防止蛋白降解、聚集、沉淀、变性、去修饰？哪种方法能够去除高丰度蛋白干扰，富集低丰度蛋白？哪种能去除核酸、多糖、脂肪等杂质？哪种方法能在有限的实验条件下，简便快速地获得高纯度且完整性好的蛋白？

比如说，有些蛋白只在特定的细胞或细胞器中以较低丰度分布，这时候可能需要分离特定的细胞或细胞器，以达到获得的蛋白样品可满足WB检测的下限；还有的蛋白在常规裂解液中易聚集或沉淀，尤其是一些多次跨膜的蛋白或核内蛋白，这种情况下就需要大家查阅参考文献来了解目标蛋白的性质和常用的提取方法。

对于特定组分的分离，可选用碧云天亚细胞组分分离试剂盒，相关产品如下：

  二.      裂解液的选择

蛋白样品制备，首先要选择合适的裂解液。一般裂解液包含以下几个组分: 

1. 缓冲系统：裂解液pH过高或过低都可能使蛋白质变性析出或水解，因此通常采用近似生理pH的buffer来作缓冲体系。Tris-HCl缓冲液因其缓冲能力强，不容易与其它离子形成不溶物，且与整个电泳系统兼容性好，因此是裂解的首选缓冲液。

2. 盐离子浓度：通常大家习惯以生理盐浓度作为裂解液的盐离子浓度。在提胞浆蛋白等易溶组分时，也有通过低盐而实现低渗，从而使细胞胀破以实现质膜分离的，这种情况下一般使用不超过50mM的NaCl。当盐离子浓度过高时，部分蛋白可能会因盐析而出现沉淀， 此外过高的离子浓度会导致泳道内局部电流过大，容易跑出笑脸状条带。实际过程中即使有少数蛋白可能需要高盐提取的，也会借助透析等方法除去可能产生干扰的盐分，最终NaCl浓度一般不能高于500mM。

3. 变性剂：常用的变性剂有两类，一类是以尿素或硫脲为代表的变性剂，另一类则是各种表面活性剂（俗称去垢剂）。变性剂的作用主要是为了使蛋白变性溶解，在膜蛋白和包涵体蛋白提取时经常会加入尿素助溶。

4. 蛋白酶、去修饰酶抑制剂：组织或细胞内通常含有大量的蛋白酶和去修饰酶，由于细胞在裂解过程中会释放出多种内源性的蛋白酶、磷酸酶、去乙酰化酶等，容易导致目标蛋白降解或去修饰，从而影响后续的蛋白检测。所以在裂解时还需加入一些酶抑制剂。

常见的蛋白酶抑制剂有：PMSF、Aprotinin、Leupeptin、 Pepstatin，AEBSF-HCl等，其中PMSF对多种不同活性中心的蛋白酶都有极好的抑制作用而且效率高，因此基本是必加的试剂。

另外，做磷酸化蛋白的Western blot时，还需要加入磷酸酶抑制剂，避免磷酸化形式的蛋白发生去磷酸化。类似地，检测乙酰化蛋白的时候还需要加入去乙酰化酶抑制剂。

碧云天生产多种多样的蛋白样品制备用酶抑制剂产品，以下是碧云天不同类型的蛋白酶、磷酸酶、去乙酰化酶抑制剂混合物：

5. 还原剂：许多蛋白天然条件下存在二硫键而形成多个分子的聚合体，另有少数蛋白在制样的过程中也会自发形成二硫键，在裂解液中引入还原剂可以有效地还原二硫键，常用的还原剂有B-巯基乙醇，DTT等。常见的上样缓冲液中会含有DTT。

裂解液的选择至关重要，碧云天生产适用于多种组织和细胞的裂解液，以下是碧云天裂解液相关产品与比较：

  三.      蛋白样品制备操作

3.1、细胞蛋白样品制备

悬浮细胞：可直接离心收集，并用PBS等洗涤1-2次去除培养液中的血清和杂质便可以裂解。

贴壁细胞：吸净培养液后，直接加入裂解液裂解，或者在吸净培养液后用PBS等洗涤1-2次后，加入裂解液裂解，收集细胞裂解液时可以根据具体情况使用细胞铲和细胞刮进行适当的辅助。也可以在胰酶消化后参考悬浮细胞的方式裂解，但很多蛋白都可以被胰酶消化，并在WB检测时可能会检测到消化出来的短片段。根据实验需要，也可用细胞刮或细胞铲刮下或铲下细胞，或用移液器吸取PBS将细胞从容器壁上吹打下来，再像悬浮细胞那样洗涤后再裂解。

不管是悬浮细胞，还是贴壁细胞，裂解操作都是相同的：加完裂解液后，将细胞置于冰上，使其充分裂解。对于裂解不充分的细胞也可以再进行冰浴超声。裂解之后离心取上清进行后续的蛋白浓度测定，加上样缓冲液煮沸等操作。

贴壁细胞通常推荐吸除培养液后直接加入裂解液裂解，因为此时细胞基本上是单层的，可以充分接触裂解液，裂解更快速和充分。

有一些研究人员喜欢使用1XSDS-PAGE上样缓冲液直接裂解细胞。这样操作的优势是快速便捷，缺点是后续不方便测定蛋白浓度以校准每个上样孔的蛋白量。

3.2、组织蛋白样品制备

组织蛋白提取则相对较复杂，首先应设法除去血液、脂肪等非目标组织。在制备脾脏、心脏和胎盘等富含血液的组织时，尤其要洗净血液，防止后续因内源IgG产生干扰。可用PBS或生理盐水（加PMSF）洗涤2-3次去除组织中血液。也可以根据具体的实验需要，在小鼠等实验动物心脏用生理盐水等灌流至肝脏和四肢颜色发白时，再采集特定的组织样品。采集好的组织样品可以立即进行后续的处理，也可以在低温冷冻保存待后续处理。

取好的组织样品需要进行破碎处理，否则难以裂解充分处理。实验室常用的破碎方法有匀浆法、研磨法等。最常见的比较便捷的方法是按照一定比例加入裂解液，用玻璃匀浆器或者适当的电动匀浆设备进行匀浆处理；最稳妥可靠的方法是把组织样品液氮冷冻后再研钵内研磨成粉末，然后再加入裂解液裂解。组织样品充分裂解后，离心取上清进行后续操作。

  四 .      操作过程中的注意事项

  五 .      蛋白浓度测定

蛋白提取完成后，可以用BCA法或Bradford法测定浓度，以确保上样量稳定可控，也可以通过SDS-PAGE后考马斯亮蓝法染胶或者在转膜后通过丽春红染色等判断每个孔的上样量是否一致，以及蛋白是否裂解充分、有无降解等。

为了保证每个泳道的上样量一致，经常需要将高浓度的样品调低浓度或减少用量，或将低浓度的样本浓缩或加大用量。调低样本浓度一般可直接用裂解液稀释。浓缩样本则建议进行超滤操作，以保证操作前后离子浓度变化不大。

样品制备的要点我们就介绍到这里最后附上一个大神总结的口诀：