总谷胱甘肽检测试剂盒/Toatal Glytathione Assay Kit

产品简介

产品简介：
    总谷胱甘肽检测试剂盒(Total Glutathione Assay Kit)是一种简单易行的检测总谷胱甘肽(GSSG+
GSH)的试剂盒。通过谷胱甘肽还原酶把氧化型谷胱甘肽(GSSG)还原成还原型谷胱甘肽(GSH)，而GSH可以和生色底物DTNB反应产生黄色的TNB和GSSG。适当配制反应体系，前后两个反应合并起来后，总谷胱甘肽(GSSG+GSH)就相当于一个颜色产生的限速因素，总谷胱甘肽的量就决定了黄色的TNB形成量。从而通过测定A₄₁₂就可以计算出总谷胱甘肽的量。
    本试剂盒的具体反应原理如下：


    两个反应相合并：

    还原型谷胱甘肽是绝大多数活细胞中巯基的主要来源，对于维护蛋白巯基适当的氧化还原状态有重要作用，并且是动物细胞中关键的抗氧化剂。总谷胱甘肽中通常90-95%为还原型谷胱甘肽。
    本试剂盒可以检测动物组织、血浆、红细胞、和培养细胞或其它适当样品中总谷胱甘肽的含量。
    本试剂盒提供了蛋白去除试剂S，可以更加准确地测定出含有蛋白的样品中的总谷胱甘肽的量。
    本试剂盒的检测下限为1μM。一个试剂盒共可以进行100次检测。
包装清单：

产品编号	产品名称	包装
S0052-1	总谷胱甘肽检测缓冲液	60ml
S0052-2	谷胱甘肽还原酶	12μl
S0052-3	还原型谷胱甘肽(GSH)	4.5mg
S0052-4	DTNB	4.5mg
S0052-5	蛋白去除试剂S	0.4g
S0052-6	NADPH	4mg
S0052-7	DMSO	1.5ml
—	说明书	1份

保存条件：
    NADPH-20℃保存，其余4℃保存，半年有效。还原型谷胱甘肽配制成溶液后，需适当分装，-20℃保存至少3个月有效。DTNB溶解在DMSO中后，需适当分装，-20℃保存至少3个月有效。蛋白去除试剂S配制成溶液后可以4℃保存。NADPH溶解后，适当分装，-70℃保存。
注意事项：
    本试剂盒检测时牵涉到氧化还原反应，所有氧化剂或还原剂都会干扰本试剂盒的测定。特别是DTT、巯基乙醇等含有巯基的试剂会严重干扰本试剂盒的测定，请尽量避免。
    一定要严格控制反应时的温度和反应时间，否则需每次都做标准曲线。
    NADPH等试剂不太稳定，要严格按照后续说明操作，谨防失活。
    为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明

使用说明：
1. 试剂盒的准备工作：
a.  GSH储备液的配制：在本试剂盒提供的4.5mg GSH中加入1.5毫升Milli-Q级纯水，溶解并混匀，即为
    GSH储备液，浓度为10mM。除立即待用部分外，其余GSH储备液适当分装后-20℃保存。
b.  DTNB储备液的配制：在本试剂盒提供的4.5mg DTNB中加入1.5毫升本试剂盒提供的DMSO，溶解并混
    匀，即为DTNB储备液。除立即待用部分外，其余DTNB储备液适当分装后-20℃保存。
c.  蛋白去除试剂S溶液的配制：在本试剂盒提供的0.4克蛋白去除试剂S中加入8毫升Milli-Q级纯水，配
    制成8毫升5%的水溶液。4℃保存。
d.  NADPH储备液的配制：在本试剂盒提供的4mg NADPH中加入100微升Milli-Q级纯水，溶解并混匀，即
    为NADPH储备液。除立即待用部分外，其余NADPH储备液适当分装后-70℃保存。
e.  40倍稀释谷胱甘肽还原酶的配制：取1微升谷胱甘肽还原酶，加入39微升总谷胱甘肽检测缓冲液，混
    匀，即成40倍稀释的谷胱甘肽还原酶。
f.  总谷胱甘肽检测工作液的配制：根据待检测的样品数参考下表配制适当量的总谷胱甘肽检测工作
    液，表中三种试剂按比例混合后即为总谷胱甘肽检测工作液。

	1个样品	10个样品	20个样品
40倍稀释谷胱甘肽还原酶	4.3 μl	43 μl	86 μl
DTNB储备液	2.2 μl	22 μl	44 μl
总谷胱甘肽检测缓冲液	150 μl	1.5 ml	3 ml

g.  0.16mg/ml NADPH的配制：取2微升NADPH储备液，加入500微升总谷胱甘肽检测缓冲液，混匀即为
    0.16mg/ml NADPH。每检测一个样品需50微升0.16mg/ml NADPH。
2. 标准品的准备：
    把10mM GSH储备液用蛋白去除试剂S溶液稀释成50μM GSH溶液。然后依次稀释成25、15、10、5、2μM
    GSH溶液。取50、25、15、10、5、2μM GSH溶液六个点做标准曲线。注意：由于GSH在蛋白去除试剂S
    溶液中不太稳定，用蛋白去除试剂S溶液配制的GSH溶液必须新鲜配制后使用，不可冻存后再使用。
3. 样品的准备：
a.  组织样品的准备。取组织用液氮速冻，然后研成粉末。每10毫克研碎的组织粉末，加入30微升蛋
    白去除试剂S溶液，充分Vortex。再加入70微升蛋白去除试剂S溶液，用玻璃匀浆器充分匀浆(对于比
    较容易匀浆的组织可以不用液氮速冻等处理，而直接加入适量蛋白去除试剂S溶液进行匀浆)。4℃放
    置10分钟后，10,000g 4℃离心10分钟，取上清用于总谷胱甘肽的测定。样品需暂时4℃保存，不立
    即测定的样品可以-70℃保存，但不宜超过10天。对于处理好的组织样品通常需用蛋白去除试剂S溶
    液进行适当稀释后再进行测定，稀释倍数通常为5-20倍。
b.  细胞样品的准备。请尽量使用新鲜的细胞进行测定，而不要使用冻存的细胞进行测定。PBS洗涤细
    胞一次，离心收集细胞，吸尽上清。加入细胞沉淀体积3倍量的蛋白去除试剂S溶液，即如果细胞沉
    淀为10微升，则加入30微升蛋白去除试剂S溶液，充分Vortex。(细胞沉淀的体积可以根据细胞沉淀
    的重量进行估算。收集细胞前后分别对离心管进行称重，从而就可以计算出细胞沉淀的重量。10毫
    克细胞沉淀的体积可以粗略地看做10微升。) 然后利用液氮和37℃水浴对样品进行两次快速的冻
    融。4℃或冰浴放置5分钟。4℃，10,000g离心10分钟。取上清用于总谷胱甘肽的测定。样品需暂时
    4℃保存，不立即测定的样品可以-70℃保存，但不宜超过10天。对于处理好的细胞样品通常需用蛋
    白去除试剂S溶液进行适当稀释后再进行测定，稀释倍数可以高达20倍。
c.  红细胞或血浆样品的准备。请尽量使用新鲜的血液进行测定。600g离心10分钟，沉淀为红细胞，
    上清为血浆。对于红细胞，用PBS洗涤两次。取约50微升红细胞沉淀或血浆，加入50微升蛋白去除试
    剂S溶液，充分Vortex。4℃或冰浴放置10分钟。4℃，10,000g离心10分钟。取上清用于总谷胱甘肽
    的测定。样品需暂时4℃保存，不立即测定的样品可以-70℃保存，但不宜超过10天。对于处理好的
    红细胞样品最后需用蛋白去除试剂S溶液稀释10倍后再进行后续的测定，而对于血浆样品，应直接取
    10微升进行测定。
d.  对于一些谷胱甘肽含量特别低的样品，可以通过冷冻干燥进行浓缩后再进行测定。
4. 样品和标准品的测定：
a.  参考表1，使用96孔板，依次加入样品或标准品，混匀。加入150微升总谷胱甘肽检测工作液后，混
    匀，25℃或室温孵育5分钟。
    表1

	空白对照 (blank)	标准曲线 (standard)	样品(sample)
样品或标准品	0 μl	10 μl	x μl
蛋白去除试剂S溶液	10 μl	0 μl	10-x μl
总谷胱甘肽检测工作液	150 μl	150 μl	150 μl
25℃或室温孵育	5 min	5 min	5 min
0.16mg/ml NADPH	50 μl	50 μl	50 μl

b.  加入50微升0.16mg/ml NADPH溶液，混匀。
c.  立即用酶标仪测定A₄₁₂，每5分钟测定一次或实时测定，共测定25分钟，测得5个数据。(说明：为了
    简化实验步骤，可以在加入NADPH溶液混匀后25分钟，仅测定一次A₄₁₂)。如果仪器可以设置温度，
    把温度设置在25℃，否则就在室温状况下测定。如果酶标仪不能测定A₄₁₂，可以测定405-414nm附近
    范围的吸光度。
5. 样品中总谷胱甘肽含量的计算：
a.  单点测定法：即反应25分钟后仅测定一次吸光度。根据不同浓度标准品测得的不同吸光度作出标
    准曲线。样品对照标准曲线即可计算出总谷胱甘肽的含量。实际计算出来的总谷胱甘肽的含量相当
    于把氧化型谷胱甘肽的含量乘以2再加上还原型谷胱甘肽的含量。单点法测定相对比较便捷，而动力
    学法测定则相对比较精确。
b.  动力学测定法：先根据不同时间点测定得到的吸光度值计算出ΔA₄₁₂/min。然后以标准品的浓度为
    横坐标，以ΔA₄₁₂/min为纵坐标，做出标准曲线。根据样品的ΔA₄₁₂/min，对照标准曲线就可以计算
    出测定时样品中总谷胱甘肽的含量。
c.  同时根据样品的稀释倍数、以及最初样品的使用量，可以计算出每毫克组织或细胞中的总谷胱甘肽
    的含量。对于细胞样品，也可以根据最初细胞的使用数量，然后另外取一定数量的细胞裂解后测定
    蛋白浓度，从而计算出细胞样品的蛋白量，最后计算出每毫克蛋白中总谷胱甘肽的含量。

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