碧云天生产的猫细小病毒(FPV)等温扩增变色检测试剂盒，即Feline Panleukopenia Virus (FPV) Colorimetric LAMP Assay Kit，也称猫细小病毒(猫泛白细胞减少症、猫瘟)等温扩增变色检测试剂盒、Feline Parvovirus (FPV) Colorimetric LAMP Assay Kit，是一种通过环介导等温扩增(Loop Mediated Isothermal Amplification, LAMP)法扩增猫细小病毒DNA，并通过反应体系的颜色变化检测猫是否感染细小病毒的试剂盒。本试剂盒采用了dU掺入和UDG酶防止等温扩增产物污染技术，可快速、有效、高灵敏度地检测猫细小病毒，并且采用可视化变色技术，无需电泳，通过肉眼观察颜色变化即可判断结果。

猫细小病毒(Feline panleukopenia virus or parvovirus, FPV)，又称猫瘟热病毒、猫泛白细胞减少症病毒、猫传染性肠炎病毒，是一种单链DNA病毒，属于细小病毒科细小病毒属。在电子显微镜下，FPV呈圆形或六角形，无囊结构[1]。基因组长度约为5200nt，包含两个开放阅读框(Open reading frame, ORF)，分别编码结构蛋白(VP1和VP2)和非结构蛋白(NS1和NS2)。受FPV感染的动物白细胞急剧下降，同时伴有严重的发热、呕吐、腹泻等症状。病毒主要侵害幼猫，几乎所有猫科动物易感，死亡率较高，可通过患病动物的粪便、尿液和呕吐物迅速传播，在可妊娠期间垂直传播，导致胎儿小脑发育不全。因此，早期和快速诊断FPV是非常必要的，以便分离受感染的猫并实施针对性治疗，降低发病率和死亡率。

FPV感染的主要症状为发热、呕吐、腹泻，在临床上极易与其它胃肠道疾病混淆，因此仅依靠临床表现来诊断是否感染FPV较为困难。到目前为止，临床诊断FPV感染的方法有电子显微镜(Electron microscope, EM)、病毒分离(Virus isolation, VI)、乳胶凝集(Latex agglutination test, LAT)、血球凝集(Hemagglutination, HA)、ELISA和PCR分析等[2]。虽然电子显微镜和病毒分离较为特异和敏感，但这些技术在临床使用过程中昂贵且耗时。乳胶凝集法虽然检测速度快，但缺乏特异性。对于血球凝集或血清凝集抑制实验，由于FPV血凝活性弱且该方法对操作条件要求较高，相关实验条件较为苛刻，在临床检测中也易出现假阴性结果。此外，虽然ELISA和PCR因其高灵敏度和特异性被广泛使用，但仍需配备相关的仪器设备，相关检测人员也需具有相应的技术能力，导致该方法的适用性受到一定的限制。

等温扩增技术(Isothermal amplification technology)是核酸体外扩增技术，其反应过程始终维持在一定的恒定温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物进行核酸的快速扩增[3]。本试剂盒采用的是环介导核酸等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)，其特点是针对靶基因的6个区域设计4-6条特异引物，使用链置换DNA聚合酶(Bst DNA Polymerase)启动DNA的合成，形成哑铃状互补链，并进一步通过连续链置换进入循环扩增阶段，扩增的最后产物是具有不同个茎环结构、多环花椰菜样结构的DNA的混合物。LAMP仅需在等温条件下(如60-65ºC)保温30-60分钟，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，LAMP不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，具有简单、快速、灵敏性高、特异性强等特点[4]。本试剂盒以猫细小病毒VP2基因最保守的区域作为LAMP靶点，设计特异性并对于猫细小病毒的大部分突变体有兼容性的引物。

本试剂盒灵敏度高，反应时间短。本试剂盒的灵敏度比传统的PCR方法高2-5倍，通过阳性质粒计算检测下限约为20-500 copies/μl，且仅需45分钟就能完成检测反应。

本试剂盒特异性强。本试剂盒根据猫细小病毒保守序列设计6条特异引物，不会与其它生物的DNA发生交叉反应。

本试剂盒采用可视化变色技术，无需电泳，通过肉眼观察颜色变化即可判断结果。本试剂盒优化了指示剂染料，猫细小病毒DNA片段被快速大量扩增后，反应管内液体的颜色由紫罗兰或蓝紫色变成天蓝色或深天蓝色即为猫细小病毒阳性。

图1.碧云天猫细小病毒(FPV)等温扩增变色检测试剂盒(D7586)的检测效果图。不含猫细小病毒基因质粒，和含10fg、100fg、1pg、10pg和100pg的猫细小病毒基因质粒的样品使用本试剂盒进行检测，反应条件为61ºC 45分钟，低至10fg阳性质粒就可以观察到非常显著的颜色变化，而不含该阳性质粒的样品颜色无变化。本图仅供参考，不同批次的产品，阴性和阳性的颜色可能会与本图略有差异，实际检测时阳性和阴性相比有明显的颜色变化即可。

本试剂盒采用防污染技术，有效避免污染。本试剂盒使用了dU和热敏型UDG酶，可以使扩增产物中掺入dU并且在等温扩增前37ºC孵育5-15分钟可有效消除等温扩增过程中带来的产物污染问题。在进行等温扩增时，热敏型UDG酶会被失活，从而不会干扰后续的等温扩增检测。

本试剂盒提供了阳性对照Positive Control，可用于确定试剂盒是否能正常工作。建议每次检测都设置阳性对照。

本产品如果用于常规的20µl反应体系，小包装可以进行25次检测，中包装可进行100次检测。

-20ºC保存，一年有效。其中LAMP Master Mix with UDG (2X)需避光保存。尽量避免反复冻融。

使用前需确保试剂完全融化，上下颠倒轻轻混匀后使用。混匀过程中尽量避免产生气泡。

经测试，本产品反复冻融10次对使用效果无显著影响，但仍需尽量避免反复冻融。反复冻融可能使产品性能下降。

等温扩增是超高灵敏度的检测，请尽量在标准的PCR实验室中进行检测。等温扩增反应设置区域须尽量避免各种可能的扩增产物的污染。尽管本试剂盒采用UDG酶防污染技术，但请仍勿打开PCR管盖，等温扩增产物宜密封后按扩增后产物要求处理，以避免超高浓度的扩增产物由于气溶胶等因素污染实验环境。

本产品含颜色指示剂，未进行反应前，如果加入样品后颜色和阴性、阳性颜色有明显差异，则需要稀释样品或者使用DNA提取试剂盒处理样品，或者需要适当调整样品的pH至接近中性。

本等温扩增体系需要高浓度的二价离子，样品中不能含有高浓度的EDTA等金属离子螯合剂。

建议使用带滤芯的吸头配制等温扩增体系，可以最大限度的避免污染导致的假阳性。推荐BeyoGold™无菌滤芯盒装吸头(FTIP631/FTIP635/FTIP638)。

移液器使用前后建议使用DNA清除试剂处理，以避免可能的假阳性。推荐使用RNase, DNase, RNA and DNA Away (R0127)。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。