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核酸相关> 反转录与PCR> 定量PCR
SYBR Green I (10,000X in DMSO, qPCR Grade)
产品编号: D7405-2ml
产品包装:2ml
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价格: ¥ 1698.00
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产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
D7405-0.1ml SYBR Green I (10,000X in DMSO, qPCR Grade) 0.1ml 158.00元
D7405-0.5ml SYBR Green I (10,000X in DMSO, qPCR Grade) 0.5ml 528.00元
D7405-2ml SYBR Green I (10,000X in DMSO, qPCR Grade) 2ml 1698.00元

碧云天生产的SYBR Green I (10,000X in DMSO, qPCR Grade)是一种使用便捷、高灵敏度、高品质的核酸荧光染料,适用于qPCR、等温扩增或基因芯片等的荧光染色定量,也可以用于DNA或RNA进行琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳时的荧光染色。

qPCR (Quantitative PCR)即定量PCR,也称实时荧光定量PCR或实时定量PCR (Real-time quantitative PCR)、实时PCR (Real-time PCR),是一种在DNA扩增反应过程中,以荧光定量测定每个聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。qPCR常用的两种方法是SYBR Green等荧光染料法和探针法。SYBR Green等荧光染料法是使用与DNA结合的荧光染料SYBR Green等以检测PCR过程中积累的PCR扩增产物[1,2]。

SYBR Green I,CAS号为163795-75-3,是一种结合于双链DNA (Double-strand DNA, dsDNA)双螺旋小沟区域的绿色荧光染料, SYBR Green I在游离状态下的荧光比较微弱,一旦与双链DNA结合后,其荧光会大大增强[3],其最大吸收波长约为497nm,最大发射波长约为520nm。荧光强度与体系中双链的浓度成正比,荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。这样通过检测荧光强弱就可以定量检测PCR过程中扩增产生的双链DNA的数量。SYBR Green I也可以和双链RNA (Double-strand RNA, dsRNA)有较强的结合,和单链RNA或单链DNA的结合力较弱。长度较长的单链RNA通常比较容易形成二级结构,其中会包含双链RNA,因此通常也比较容易被SYBR Green I染色。SYBR Green I对于不易形成二级结构的非常短的单链RNA或DNA的染色非常弱。

本产品使用便捷、灵敏度高、信噪比好,在使用时将经过稀释的本产品直接添加到qPCR反应体系中,无需额外的步骤或特殊处理。

如果用于常规的qPCR检测,反应体系为20µl,使用终浓度为1X时,本产品每0.1ml可以进行约5万次检测,本产品每0.5ml可以进行约25万次检测,本产品每2ml可以进行约100万次检测。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D7405-0.1ml SYBR Green I (10,000X in DMSO, qPCR Grade) 0.1ml
D7405-0.5ml SYBR Green I (10,000X in DMSO, qPCR Grade) 0.5ml
D7405-2ml SYBR Green I (10,000X in DMSO, qPCR Grade) 2ml
说明书 1份
保存条件:

-20ºC避光保存,至少一年有效。4ºC避光保存,至少3个月有效。

注意事项:

本产品为荧光染料,须避光保存,但在使用过程中的常规室内光照不会影响其使用效果。

收到本产品后建议分装成小管冻存于-20ºC,短期内使用可以4ºC保存,避免反复冻融,实验过程应在冰上操作。

SYBR Green I是碱不稳定的,一旦降解就会抑制PCR反应。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1. 在使用前需将本产品混匀,使用DMSO (ST038)或超纯水(ST873/ST876)对本产品进行稀释。通常可将本产品稀释至20X待用,例如10µl SYBR Green I (10,000X in DMSO, qPCR Grade)加入5ml超纯水,即为SYBR Green I (20X)。
2. 参考下表在室温或冰浴上设置qPCR反应体系(以96孔板为例):
Reagent Final Concentration Volume for One qPCR Reaction (20μl)
10X PCR Buffer (with Mg2+) 1X 2μl
dNTP (2.5mM each) 0.2mM each 1.6μl
Template DNA 1-10ng cDNA x μl
SYBR Green I (20X) 0.2X-1X 0.2-1μl
Forward and Reverse Primer Mix (2.5μM each) 0.25μM 2μl
Taq DNA Polymerase (5U/μl) 0.5U/20μl 0.1μl
Ultrapure Water - To 20μl
注1:SYBR Green I的加入会影响镁离子(Mg2+)的最佳浓度,镁离子浓度影响引物退火、产物特异性和酶活性,而提高镁离子浓度能够降低SYBR Green I对PCR反应的抑制作用[4]。因此,在使用SYBR Green I进行qPCR反应时,镁离子浓度要比无SYBR Green I的普通PCR反应高0.5-3mM。
注2:通常DNA模板的量以1-10ng cDNA或10-100ng基因组DNA为参考用量。因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数同,如有必要,可对模板进行梯度稀释,以确定最佳的模板使用量。RT-PCR反应得到的cDNA直接作为模板时,其添加量不要超过PCR反应总体积的10%。
注3:SYBR Green I的使用浓度会对实验产生影响,浓度过低会使荧光信号不能反应产物量的变化,影响PCR反应灵敏度;而浓度过高则会抑制PCR反应,降低PCR反应效率。使用时应根据实际情况对其使用浓度进行调整,用户可以在0.2X-1X范围内摸索SYBR Green I的最佳使用浓度。
注4:推荐使用碧云天预先设计、经过qPCR验证、预混的引物对产品。
注5:Taq酶的用量须根据酶活、是否热启动等进行调整。
注6:须根据qPCR是否需要ROX,适当添加ROX。
注7:本qPCR反应体系各组分浓度仅供参考,实际须进行严格的优化。
3. qPCR反应程序:
根据qPCR及Taq酶的扩增效率设置qPCR反应程序。建议采用如下的PCR程序,本程序是以ABI QuantStudio™ 6 Flex荧光定量PCR仪为例:
a. 预变性:95ºC 2分钟;
b. 变性:95ºC 15秒;
c. 退火/延伸:60ºC 15-30秒;
d. 重复步骤b和步骤c,总共40个循环;
e. 熔解曲线分析(可选):95ºC 15秒, 60ºC 15秒, 95ºC 15秒;
f. 使用荧光定量PCR仪提供的软件分析结果。
注:以上举例为常规qPCR反应系统,仅供参考。实际反应条件因模板、引物等的结构不同而各异,需根据模板、引物、目的片段的特点设定最佳反应条件,并根据比例放大或缩小反应体系。上述为两步法qPCR,如果采用三步法qPCR,只需在退火/延伸后加一步72ºC 30秒,随后重复步骤b、c及增加的这一步骤共40个循环即可。
4. 核酸琼脂糖凝胶电泳的使用,参考以下方式。
方式1:样品中加入SYBR GreenⅠ后电泳。
在电泳之前需配制SYBR GreenⅠ工作液,使用超纯水(ST873/ST876)将10,000X母液稀释100倍至100X。按常规方法配制不加任何染料的琼脂糖凝胶,凝胶厚度不超过5mm。将100X SYBR GreenⅠ工作液与DNA样品或DNA Marker以1:1比例混合,加入6X Loading Buffer (若DNA Marker中已含有Loading Buffer则可不加),室温静置10min。按常规方式上样、电泳。
方式2:电泳完毕后对琼脂糖凝胶染色。
按照每100毫升缓冲液(TAE、TBE或TE,pH7.5-8.0)加入40微升SYBR GreenⅠ的比例(2500:1)加入SYBR Green (10,000X),配制成SYBR GreenⅠ染色液。把电泳完毕的琼脂糖凝胶放到适当的容器中,加入适量上述配制好的SYBR GreenⅠ染色液,确保至少盖住凝胶。在摇床上缓慢摇动(30-50rpm)染色30-60分钟。染色的时间根据胶的厚度而定,胶厚则染色时间需要长一些,胶薄则染色时间可以短一些。染色完毕后,可使用约500nm波长蓝光激发或相应的凝胶成像系统检测,也可以使用常规的紫外灯或紫外凝胶成像检测系统,但强度会弱一些。染色液可以重复使用4次左右。如果希望获得更好的染色效果图片,染色后可以使用超纯水适当洗涤,以降低背景荧光。
方式3:琼脂糖凝胶中添加SYBR GreenⅠ。
根据需要配制适当浓度(例如1-3%)的琼脂糖胶液。在琼脂糖完全融解后,适当冷却但又不会使琼脂糖凝固时,按照每100毫升胶液加入20-40微升SYBR GreenⅠ的比例(5000-2500:1)加入SYBR GreenⅠ(10,000X)。混匀后即可把琼脂糖胶液倒入制备凝胶的模具中。适当量的DNA在该胶中电泳35-45min后,用约500nm波长蓝光激发或相应的凝胶成像系统检测,就可以观察到明亮的核酸条带。也可以使用常规的紫外灯或紫外凝胶成像检测系统,但强度会弱一些。
注1:可根据实际染色效果对SYBR GreenⅠ的使用浓度进行适当的调整。
注2:方式2即“电泳完毕后对琼脂糖凝胶染色”的效果相对更好一些,但SYBR GreenⅠ的整体染色效果一般,特别是1000bp以下的小片段。对于蓝光下检测,更推荐NA-Green (EB升级换代产品, 2000X) (D0133/D0135)、NA-Green Plus (EB升级换代产品, 2000X) (D0136)、Gel-Green (EB升级换代产品, 10000X) (D0143/D0145)、Gel-Green Plus (EB升级换代产品, 10000X) (D0147),效果更佳。
参考文献:
1. Marilynn R Fairfax, Hossein Salimnia. Molecular Diagnostics. 2010. Pages 3-14.
2. Cao H, Shockey JM. J Agric Food Chem. 2012. 60(50):12296-303.
3. Xiang D, Zhai K, Xiang W, Wang L. Talanta. 2014. 129:249-53.
4. Karsai A, Müller S, Platz S, Hauser MT. Biotechniques. 2002. 32(4):790-2, 794-6.
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产品编号 产品名称 包装
D7405-0.1ml SYBR Green I (10,000X in DMSO, qPCR Grade) 0.1ml
D7405-0.5ml SYBR Green I (10,000X in DMSO, qPCR Grade) 0.5ml
D7405-2ml SYBR Green I (10,000X in DMSO, qPCR Grade) 2ml
R0021 DEPC水(DNase、RNase free) 100ml
R0022 DEPC水(DNase、RNase free) 500ml
ST038-100ml DMSO 100ml
ST038-500ml DMSO 500ml
ST873-100ml BeyoPure™ Ultrapure Water (PCR级, Sterile) 100ml
ST876-100ml BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free,Sterile) 100ml
ST876-500ml BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free,Sterile) 500ml
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