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 Taq DNA Polymerase

  产品编号D7209
  产品包装: 5000U
  产品价格: 392.00元
产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
D7209 Taq DNA Polymerase 5000U 392.00元

      Taq DNA Polymerase简称Taq酶,是最常用的DNA聚合酶之一。
      Taq DNA Polymerase是一种来源于嗜热菌Thermus aquaticus的高度热稳定的DNA聚合酶,95℃孵育时的半衰期大于40分钟。Taq酶的分子量为94 kDa。Taq酶可以催化5’至3’方向的依赖于DNA模板的脱氧核苷酸的聚合。Taq酶没有3’至5’的外切酶活性,有非常低的5’至3’外切酶活性。由于Taq酶没有3’至5’的外切酶活性,因此在DNA聚合过程中相当于核苷酸转移酶的作用,最终会导致PCR产物的3’末端会产生3’-dA overhangs,即产生带一个A的3’粘端。
      来源:本Taq DNA Polymerase为recombinant Taq DNA Polymerase,通过大肠杆菌表达纯化获得,和纯化获得的天然Taq DNA Polymerase在各方面的性质相同。
      用途:PCR、DNA标记和测序等。
      本Taq酶可以扩增长度达5 kb的DNA片段,最长可以扩增长达8kb的DNA片段。通常适合扩增3kb以下的DNA片段。
      用本Taq酶扩增产生的PCR产物带有3’-dA overhangs,可以用于基于T载体的PCR片段克隆。
      PCR反应过程中可以掺入生物素、地高辛或一些荧光机团标记的脱氧核苷酸,即可以用核酸的标记反应。
      本Taq酶除用于各种PCR扩增以及DNA标记外,还可以用于DNA测序。
      活性定义:One unit of the enzyme catalyzes the incorporation of 10 nmol of deoxyribonucleotides into a
polynucleotide fraction (adsorbed on DE-81) in 30 min at 70℃. Enzyme activity is assayed in the following mixture: 67 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25℃), 6.7 mM MgCl2, 1 mM 2-mercaptoethanol, 50 mM NaCl, 0.1 mg/ml BSA, 0.75 mM activated calf thymus DNA, 0.2 mM of each dNTP, 0.4 MBq/ml [3H]dTTP。
      纯度:不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶,不含RNA酶,满足常规PCR反应要求。
      酶储存溶液:20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 100 mM KCl, 0.5% (v/v) Nonidet P40, 0.5% (v/v)
Tween 20 and 50% (v/v) glycerol。
      10X PCR Buffer (with Mg2+):100 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25℃), 500 mM KCl, 15mM MgCl2, 0.8% (v/v) Nonidet
P40。
      失活或抑制:酚氯仿抽提可以使Taq酶失活,加入脱氧胆酸钠至0.06%,SDS至0.01%,或sarkosyl至0.02%均可以抑制Taq酶。
      本产品用于50微升的PCR反应体系,足够用于4000个反应;用于20微升的PCR反应体系,足够用于10000个反应。
包装清单:

产品编号 产品名称 包装
D7209-1 Taq DNA Polymerase (5U/μl) 5000U
D7209-2 10X PCR Buffer (with Mg2+) 10ml×2
说明书 1份

保存条件:
      -20℃保存。
注意事项:
      由于PCR反应非常灵敏可以扩增目的基因序列超过1000万倍,在使用Taq酶时请注意避免微量待扩增DNA的污染,并尽量考虑设置不加模板的空白对照以确认是否有待扩增DNA的污染。
      Taq DNA polymerase在PCR过程中每循环的出错几率约为2.2×10-5,对于大于1kb的DNA片段的克隆推荐使用出错几率更低的DNA聚合酶,例如Pfu DNA polymerase、BeyoTaq DNA polymerase等。对于普通的PCR或RT-PCR定性检测或定量检测,Taq DNA polymerase是最佳选择。
      本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
      为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
  1. 1.PCR反应体系的设置:
    1. a.融解并混匀PCR反应所需的各种溶液。将Taq DNA Polymerase置于冰浴上或冰盒内。
    2. b.参考下表在冰浴上设置PCR反应体系(如果有多个类似的PCR反应,可以先配制大体积的包含水、buffer、dNTP和Taq酶的
    3. 混合物,然后分装到各PCR反应管内。根据情况,有时混合物中可以包括引物):
    4. 试剂 最终浓度 体积
      双蒸水或Milli-Q水 - (36.75-x)μl
      10X PCR Buffer (with Mg2+) 1X 5μl
      dNTP (2.5mM each) 0.2mM each 4μl
      模板DNA 10pg-1μg* xμl
      引物混合物(10μM each) 0.8μM 4μl
      Taq DNA Polymerase (5U/μl) 1.25U/50μl 0.25μl
      总体积 - 50μl
      • 注意:(a)通常引物的终浓度为0.2μM时可获得良好的检测效果,也可以根据情况在0.1-1.0μM范围内调整引物的终浓度。
      • 扩增效率不高的情况下,可提高引物的浓度;发生非特异性反应时,可降低引物浓度。
      • (b)对于不同类型的模板在50μl反应体积中推荐用量如下:
      • 哺乳动物基因组DNA:0.1-1μg;大肠杆菌基因组DNA:10-100ng;质粒DNA:0.1-10ng。过多的模板DNA容易
      • 导致非特异性的PCR产物。
    5. c.用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀,室温离心数秒,使液体积聚于管底。
    6. d.如果所使用的PCR仪有热盖则省略本步骤。如果PCR仪没有热盖,则在管内滴入一滴矿物油(mineral oil,ST275)。
    7. e.把设置好的PCR反应体系置于PCR仪上,开始PCR反应。
  2. 2.PCR反应参数的设置可以参考如下示例:
    • STEP1(起始变性): 94℃ 3min
    • STEP2(变性): 94℃ 30sec
    • STEP3(退火): 55℃ 30sec
    • STEP4(延伸): 72℃ 1min
    • STEP5(循环): Go To STEP2 for 30 cycles
    • STEP6(最终延伸): 72℃ 10min
    • STEP7(临时保存): 4℃ forever
  3. 注意:
    1. a.PCR反应的设置需根据模板、引物、PCR产物的长度和GC含量等条件的不同设定不同的PCR反应条件包括温度、时间和循环
    2. 数等。
    3. b.STEP4(延伸)的时间设置需根据PCR产物的长度进行设置,通常每kb产物的延伸时间为1分钟。例如PCR产物的长度为1kb,
    4. 则延伸时间可以设置为1分钟,PCR产物的长度为2kb,则延伸时间可以设置为2分钟,以此类推。
    5. c.对于初次进行的PCR,为尽量确保可以扩增出预期的PCR产物,可以把循环数设置为35。对于需进行半定量或定量的PCR反
    6. 应循环数一定要进行适当优化,使PCR反应没有达到平台期。

常见问题:
  1. 1.PCR产物非常少或没有特异性条带。
    1. a.引物设计不佳是PCR过程中最常见的问题。请选择适当的引物设计软件进行引物设计,注意引物的GC含量、二级结构、二聚
    2. 体、退火温度、长度、特异性等方面的问题。在加入酶切位点等的引物中,一定要注意加入酶切位点等后整条引物的GC含
    3. 量、二级结构、二聚体、退火温度、长度、特异性等方面的问题。在原有引物效果不佳的情况并且阳性对照引物可以正常工
    4. 作的情况下,可以考虑更换引物。
    5. b.待扩增片段GC含量偏高。GC含量较高的情况下PCR会变得相对比较困难,此时可以使用适合扩增高GC含量DNA片段的GC-
    6. rich buffer,并相应地根据GC-rich buffer的要求或说明调整PCR反应参数的设置。
    7. c.长片段扩增。尽管Taq DNA polymerase可以扩增最长达8kb的DNA片段,但大多数时候比较适合扩增3kb以下的片段,更
    8. 长片段的扩增推荐使用其它更适合长片段扩增的DNA聚合酶。
    9. d.PCR反应设置时在室温进行容易导致非特异性条件。推荐在冰浴上设置PCR反应。
    10. e.由于引物存在一定的二级结构或存在一定的引物二聚体,或引物偏短,导致退火效果不佳。此时可以采用Touch down等方
    11. 法进行退火,通常采用从65℃逐步缓慢降温到55℃或50℃的方法,使退火更加充分。
    12. f.退火温度不佳,需要优化。如果有温度梯度PCR仪,则可以设置退火的温度梯度,摸索退火的最佳温度。如果没有温度梯度
    13. PCR仪,则可以通过多次PCR反应摸索最佳的退火温度。
    14. g.延伸时间不足。可按照每1kb片段延伸1分钟进行设置,对于较难扩增的片段可以设置为每1kb片段延伸1.5-2分钟。
    15. h.待扩增片段GC含量较高或长度较长,变性不够充分。可以调节起始变性条件至95℃ 1min甚至95℃ 2-4min。
    16. j.在不同PCR仪上进行PCR反应,避免有时PCR仪出现问题。
    17. i.循环数不足,适当延长PCR的循环数。通常循环数最高不必超过40,常用的循环数范围为25-35。
    18. k.模板含量太低,适当加大模板量,或采用巢式PCR(nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即为在原先设计的PCR引物内侧再设
    19. 计一对PCR引物,然后对第一次PCR产物进行稀释后再进行一次PCR扩增,这样一方面可以起到扩增作用,同时也可以从第
    20. 一次PCR产物中扩增出特异性条带。二次PCR则为比较简单地用原有引物对第一次PCR产物进行稀释后再进行一次PCR
    21. 扩增,可以起到扩增作用,但不能去除非特异性条带。
    22. l.模板中含有抑制PCR反应的物质,可以用适当的DNA纯化方法例如柱纯化等纯化模板DNA。
    23. m.当产生较多非特异性条带时,可以适当提高退火温度。
    24. n.注意设置适当的阳性对照和阴性对照通常会有很大帮助。

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1. Wang H, Feng F, Wang XP, Wang RS, Wu Y, Zhu MG, Zhang H, Zhuang ZX.
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Mol Med Rep. 2016 Feb;13(2):1077-82.