使用说明：
1. 样品处理：
    含有高浓度蛋白的样品例如血清、含有高浓度血清的细胞培养液，在加入Griess Reagent I后可能
    会产生沉淀。可以取50微升样品，加入50微升Greiss Reagent I进行测试，观察是否产生沉淀。如
    果产生沉淀，则可以把样品沸水浴加热5分钟，以变性蛋白，然后12,000g离心5分钟，取上清用于后
    续的测定。对于细胞或组织样品可以用碧云天生产的RIPA裂解液(弱)(P0013D)或Western及IP细胞裂
    解液(P0013)进行裂解。
2. 稀释标准品：
    用样品所使用的溶液把10mM KNO₂稀释成5、10、20、50、100微摩尔/升。例如样品为细胞裂解液，
    则用该裂解液稀释标准品；样品为细胞培养液，则用该培养液稀释标准品。
3. 试剂的准备：
    加约1ml蒸馏水或MilliQ级纯水至5mg NADH中，颠倒混匀溶解后，再用蒸馏水或MilliQ级纯水定容
    至3.2ml，配制成2mM NADH，除立即使用的部分外，其余NADH溶液必须立即分装后-70℃冻存。
    Nitrate reductase在临用前取出，试剂盒中的其余各种试剂在冰浴上溶解。Griess Reagent I和
    Griess Reagent II在使用前需达到室温。
4. 酶混合液的配制：
    配制方法参考下表：

    注意：酶混合液配制后一定要注意充分混匀！酶液容易沉降！标准品稀释液为您用于标准品稀释时
    的稀释液。例如用RIPA裂解液裂解的样品，则标准品宜用RIPA裂解液稀释，标准品稀释液即为RIPA
    裂解液。
5. 按照30微升/孔，在96孔板中加入标准品或样品，同时以相应的等量适当溶液设置空白对
   照。
    如果样品中一氧化氮的浓度很高或样品数量有限，可以加入较小体积的样品，体积不足部分用样品
    所使用的溶液补足。例如用RIPA裂解液裂解的细胞样品仅用了10微升，则加入20微升RIPA裂解液以
    补足体积。
6. 每孔加入30微升酶混合液，轻轻混匀。
7. 30℃反应20分钟。
    可以在30℃的培养箱或其它合适的保温设备内进行反应。如果没有合适的仪器设备，也可以20-30℃
    室温反应20-60分钟。延长反应时间不会影响检测结果。另外，不宜在37℃进行反应。
8. 每孔加入50微升室温Griess Reagent I，轻轻混匀。
9. 每孔加入50微升室温Griess Reagent II，轻轻混匀。
    可以在侧摆摇床或水平摇床上轻轻摇动。
10. 540nm测定吸光度，根据标准品计算出样品中一氧化氮的浓度。
    如无540nm滤光片，520-560nm的滤光片也可以使用。如无酶标仪或合适的滤光片，也可以通过目测
    比色，确定样品中一氧化氮的浓度。目测比色时标准品需要更为精细的浓度梯度。

常见问题：
1. 检测结果标准曲线良好，但样品的吸光度很低，和空白对照接近，怎么办？
    标准曲线良好说明检测方法和检测试剂盒基本上没有问题，样品吸光度低说明样品中一氧化氮含量
    很低。可以采取的办法是：
    (1)加大样品和标准品的使用量至60微升，其余试剂用量不变，这样可以增加检测灵敏度接近1倍。
    (2)把整个检测体系每种试剂的用量加大50%，这样可以使检测灵敏度增加约50%。同时也可以考虑浓
    缩样品，即一方面在收集样品的时候尽量使一氧化氮的浓度保持得较高(例如裂解细胞时采用较小体
    积的裂解液)，另一方面可以考虑用真空干燥或真空冷冻干燥的方法浓缩样品。

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