使用说明:
1.G418储存液的配制(50mg/ml,活性浓度)
a.活力单位的换算
根据此公式进行换算:(1000/A0)×A1=A2,其中A0是G418的活力值(Potency),因批次而异,具体见瓶子的标签。A1是想配制的活性G418浓度。A2是实际称重的粉末与体积比浓度。
比如若所用批次的G418 活力值为:750µg/mg,要配制50mg/ml的G418活性浓度,则实际要配制的粉末浓度为1000/750×50mg/ml=66.33mg/ml。
如果配制10ml的G418储存液(活性浓度,50mg/ml),则需要称取663.3mg粉末。
b.除菌和保存
根据上述换算得到的实际粉末称重量,加入10ml无菌去离子水使其完全溶解。
先用5ml无菌去离子水预湿润0.22μm针头式过滤器,除尽水。之后使用此滤器过滤,除菌后分装成单次使用的小量(如1ml)放到-20℃冻存,1年稳定。
注:不要对混浊的溶液进行过滤,因为混浊的溶液意味着药物未完全溶解,过滤过程中会造成药物损失,降低活性;不建议使用液体培养基,NaCl,磷酸盐溶液或者有机溶剂来制备储存液;配制G418溶液时,一定要根据相应批次G418标注的活力值(potency)来进行换算,从而得到需要活性浓度的储存液以及工作液。
2.建议使用浓度
一般来说,刚开始筛选转化子需要高浓度的G418,并用一个较低浓度的G418维持培养。生长条件,细胞类型和其它的环境因素都可能影响G418的用量,因此第一次使用的实验体系建议通过剂量反应性曲线(dose-response curve or kill curve),来确定最佳筛选浓度。
通常情况,哺乳动物细胞筛选范围200-2000μg/ml;植物细胞:10-100μg/ml;酵母细胞:500-1000μg/ml。
表1.部分哺乳动物细胞的推荐工作浓度表
细胞名称 细胞类型 浓度
B16 Mouse melanocytes 400-1000μg/ml
CHO Chinese hamster ovarian cells 400-800μgμg/ml
Hela Human uterine cells 200-400μg/ml
HEK293 Human embryonic kidney cells 200-500μg/ml
THP-1 Human monocytes 250μg/ml
3.遗传霉素剂量反应曲线的建立
遗传霉素的有效筛选浓度跟细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢及细胞所处细胞周期等因素相关。为了筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞株,确定能够杀死未转染宿主细胞的遗传霉素最低浓度非常重要,对于初次使用的细胞,一般需要通过实验来确定适合自身实验体系的剂量反应曲线(dose-response curve or kill curve),曲线建立时至少应设置6个遗传霉素浓度。遗传霉素处理分裂期的细胞时活性最强,因此在添加遗传霉素之前需要先将细胞培养一段时间。
a.第一天:未转化的细胞按照20-25%的细胞密度铺在合适的培养板上,37℃,CO2培养过夜。
注:对于需要更高密度来检测活力的细胞,可增加接种量。
b.根据细胞类型,设定合适范围内的浓度梯度。以哺乳动物细胞为例,可设定0、50、100、200、400、800、1000μg/ml。
c.第二天:去除旧的培养基,换用新鲜配制的含有相应浓度遗传霉素的培养基。每个浓度做三个平行孔。更换培养基后在细胞培养箱中继续培养。
d. 接下来每3-4天更换新的含药物培养基。
e.按照固定的周期(如每2天)进行活细胞计数来确定阻止未转染细胞生长的恰当浓度。选择在理想的天数(通常是7-10天)内能够杀死绝大多数细胞的最低浓度为稳定转染细胞筛选用的工作浓度。
4.稳定转染细胞株的筛选
a.细胞转染48h后,将细胞置于含有适当浓度遗传霉素的新鲜培养基中培养,此为处理组。
b.注:当细胞处于分裂活跃期时,抗生素作用最明显。当细胞过于密集,抗生素产生的效力会明显下降,所以细胞的密度最好不超过25%。建议同时做一个正常细胞的对照组。转染或感染48小时后,如果细胞过密也可以消化后重新接种细胞,培养过夜后即可进行遗传霉素筛选。每隔3-4天更换含有遗传霉素的培养液。
c.筛选7天后观察并评估细胞克隆(集落)的形成情况。对照组正常细胞应该100%死亡,处理组中存活的细胞为表达neo基因的细胞。根据宿主细胞种类和转染/筛选效率不同,集落的形成可能需要一周或者更多的时间。
d.克隆形成后,挑取并转移5-10个抗性克隆于35mm细胞培养板,继续用含药物的筛选培养液维持培养7天。
e.之后更换正常培养基培养即可。
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