使用说明：
1.膜的封闭。
a.完成转膜后，立即把印迹膜(约6.6×8.5cm)放置到预先加入
5ml BeyoWB™封闭液的Western洗膜盒(9.0×6.0×3.3cm) (
FFX050)中，置于翘板摇床上缓慢摇动，
室温封闭5分钟。推荐使用BeyoShaker™数字式翘板摇床(
E6673)。后续如果无特殊说明，各种试剂的用量都以约6.6×8.5cm大小的印迹膜为例进行说明。
注1：经反复测试，室温封闭5分钟即可达到理想的封闭效果，但也可以根据实际情况酌情延长封闭时间。
注2：如果使用裁切后约2×8.5cm印迹膜，推荐使用2ml BeyoWB™封闭液，后续使用的各种试剂的体积也须相应按比例缩小。
2.一抗孵育。
a.一抗工作液的配制。根据一抗推荐稀释比例或优化后进行常规Western检测使用的稀释比例进行一抗工作液的配制。例如一抗
推荐稀释比例为1:1000时，则在
5ml BeyoWB™抗体稀释液中加入5μl一抗并混匀，即可得到5ml一抗工作液；如果推荐稀释比例为1:500，则在5ml BeyoWB™抗体稀释液中加入10μl一抗并混匀。
b.用微型台式真空泵、移液器或滴管等吸尽用于封闭的BeyoWB™封闭液。推荐使用BeyoVac™基础型台式真空吸液器(
E6878)或BeyoVac™调速型台式真空吸液器(
E6883)。
c.加入
5ml一抗工作液。如果是裁切后的约2×8.5cm印迹膜，推荐用量为2ml。
d.置于翘板摇床上缓慢摇动，
室温孵育15分钟。
注1：经反复测试，室温孵育15分钟即可达到理想检测效果，但也可以根据实际情况酌情延长一抗孵育时间。
注2：如需4ºC孵育，推荐孵育时间为15-30分钟，或根据实际情况进行优化。
注3：一抗孵育时，请参考步骤3a进行二抗工作液的配制。
e.回收一抗工作液，留待后续重复使用。并吸净残留的一抗工作液。
f.使用
BeyoWB™ Western洗涤液洗涤3次，每次的用量为10ml，每次30秒。如果是裁切后的约2×8.5cm印迹膜，每次的推荐用量为4ml。每次推荐使用真空泵吸净残留的洗涤液。
注：经反复测试，洗涤3次，每次30秒，即可达到理想效果，但也可以根据实际情况每次酌情延长洗涤时间或增加洗涤次数。
3.二抗孵育。
a.二抗工作液的配制。通常建议根据二抗推荐稀释比例或优化后进行常规Western检测使用的稀释比例的2倍进行二抗工作液的配制。例如二抗
推荐稀释比例为1:1000时，则在本试剂盒中使用的比例为1:500，即在
5ml BeyoWB™抗体稀释液中加入10μl二抗并混匀，即可得到5ml二抗工作液。
b.加入
5ml二抗工作液。如果是裁切后的约2×8.5cm印迹膜，推荐用量为2ml。
c.置于翘板摇床上缓慢摇动，
室温孵育5分钟。
注1：经反复测试，室温孵育5分钟即可达到理想检测效果，但也可以根据实际情况酌情延长抗体孵育时间。
注2：如需4ºC孵育，推荐孵育时间为5-10分钟，或根据实际情况进行优化。
d.回收二抗工作液，留待后续重复使用。并吸净残留的二抗工作液。
e.使用
BeyoWB™ Western洗涤液洗涤3次，每次的用量为10ml，每次30秒。如果是裁切后的约2×8.5cm印迹膜，每次的推荐用量为4ml。每次推荐使用真空泵吸净残留的洗涤液。
4.蛋白检测。
a.BeyoWB™ BeyoECL工作液的配制。混合0.5ml BeyoWB™ BeyoECL A液和0.5ml BeyoWB™ BeyoECL B液，配制成1ml BeyoWB™ BeyoECL工作液，室温放置备用。工作液宜在临检测前配制。如果是裁切后的约2×8.5cm印迹膜，BeyoWB™ BeyoECL工作液配制0.4ml即可。
b.用WB专用镊子(12cm, 翘方头) (
FS035)将膜取出，用吸水纸略吸去过多的液体(切勿接触膜的蛋白面)，然后置于一洁净保鲜膜上。
c.
滴加1ml BeyoWB™ BeyoECL工作液到膜上，确保使工作液均匀覆盖在膜上，
放置30秒。如果是裁切后的约2×8.5cm印迹膜，BeyoWB™ BeyoECL工作液的推荐用量为0.4ml。
注：通常放置30秒就可以进行后续的成像或压片检测，但也可以根据实际情况酌情延长放置时间。
d.取膜，弃BeyoWB™ BeyoECL工作液，用吸水纸略吸去过多的液体。将膜放在两片保鲜膜中间，随后进行化学发光成像仪检测或压片检测。
5.(选做)一抗二抗的去除与内参蛋白的检测。
推荐使用碧云天的Western一抗二抗去除液(中性) (
P0025N)去除一抗和二抗用于后续其它目的蛋白的检测。如果希望进行内参蛋白的检测，推荐使用碧云天的Actin超快速Western检测试剂盒(
P0970)、GAPDH超快速Western检测试剂盒(
P0971)和Tubulin超快速Western检测试剂盒(
P0972)，仅需10分钟就可以实现从膜到目的条带。
注：详细的Western实验步骤可以参考碧云天的相关网页：
http://www.beyotime.com/support/western.htm。
参考文献：
1.Begum H, Murugesan P, Tangutur AD. Biotechniques. 2022. 73(1): 58-69.
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