使用说明：
1.BeyoGold™细胞小室的使用：
a.在细胞小室内接种细胞时，应先将适量预热的培养液加入多孔板的孔中，再用镊子将细胞小室放入相应孔中，在放入时，建议将细胞小室稍稍倾斜，一侧先接触液面，以免垂直放入在小室下生成气泡。最后在细胞小室中进行细胞接种。
注1：推荐的培养液体积请参考表2.“碧云天BeyoGold™细胞小室尺寸及推荐加液量表”。
注2：接种密度对于细胞小室内细胞贴壁和生长情况有一定影响，初次使用时，推荐接种一系列密度梯度的细胞，以确定最佳接种密度。
注3：细胞小室膜孔径大小可直接影响接种细胞的形态和密度。
注4：细胞小室在放置过程中如果有气泡产生，下层培养液的作用就会减弱甚至消失，因此需特别注意。一旦出现气泡，需将小室提起，去除气泡后重新放置。
b.预平衡可以提高细胞的贴壁效率，促进细胞的穿膜。具体操作为将预热至37ºC的无血清培养液加入多孔板和细胞小室中，然后置于培养箱内平衡至少1小时或过夜。平衡完毕后，再进行细胞的接种。
c.上、下室同时接种细胞时，因上、下室培养面积有差异，上室的有效生长面积比下室小，故上室接种的细胞量应少一些。
d.BeyoGold™细胞小室顶部有三个开口以便于用吸头从下部添加或吸取样品。
e.对细胞小室单细胞层进行直接固定和染色：在多孔板中加入一系列固定和染色的溶液，将细胞小室依次浸泡(细胞小室内也需要酌情加入适量的固定和染色溶液)而完成固定和染色的过程。固定和染色后，如有必要可使用解剖刀将膜割下作长期保存。
f.如需从细胞小室中收集细胞，建议同时洗涤细胞小室和培养板，并将分离试剂(胰酶等)同时加在细胞小室中和多孔板孔中，然后按照常规的细胞收集办法进行收集。
2.侵袭实验：
一般选用5、8μm膜孔径的可允许细胞穿膜的细胞小室，下室为诱导剂(Chemoattractants)，上室接种细胞，侵袭实验需要细胞在穿过细胞小室膜的同时，还需要通过穿过涂有基底膜模拟物质(基质胶)的膜表面。本步骤以BeyoGold™细胞小室24孔板套装为例，其它规格多孔板可按比例进行相应试剂用量的调整。
a.基质胶用于细胞小室的包被：
(a)将Matrix-Gel™基质胶(标准型) (C0371/C0372)置于冰中并在4ºC融化，使用预冷的移液管或吸头混合基质胶至均匀状态。
(b)在冰上，将基质胶用无血清培养液按照1:8的比例进行稀释，例如取8µl基质胶加入64µl不含血清的培养液中，使用预冷的吸头混合至均匀状态。注：常用的稀释比例为1:4、1:6、1:8，可根据实验具体情况调整稀释比例。
(c)取60µl上述混合溶液垂直加入细胞小室中，使其均匀平铺在底部，注意均匀铺胶，不要产生气泡。随后置于37ºC孵育3小时。
(d)吸出未结合的基质胶。注：需确保移液管的尖端不会刮伤凝胶层表面。
(e)加入100µl不含血清的培养液，将培养板置于37ºC培养箱孵育30分钟，进行水化。
(f)去除小室中液体，检查是否有液体穿过小室进入到下室中，若没有，则可用于接种细胞。
b.细胞悬液制备：
(a)(选做)对细胞进行12-24小时的饥饿处理。
(b)消化细胞，用不含血清的培养液重悬，调整细胞密度为5-50万个/ml。注：不同细胞的迁移能力不同，可设置一系列细胞密度梯度摸索合适的细胞密度。
c.细胞接种：
(a)取500µl含10% FBS的培养液加入24孔板，用镊子将细胞小室置于24孔板内。
(b)取200µl细胞悬液加入细胞小室。
(c)将24孔板置于培养箱中培养24-48小时。注：接种细胞1-2小时后，可对培养板进行检查，确保没有大气泡产生。
d.细胞固定、染色：
(a)取出细胞小室，去除培养液，用棉签轻轻擦拭基质胶及细胞。
(b)在24孔板干净的孔中加入600µl 4%多聚甲醛固定液(P0099)，将细胞小室放入固定20-30分钟。
(c)弃固定液，PBS洗涤细胞小室1次。注：需避免触碰细胞小室底部。
(d)在24孔板干净的孔中加入适量结晶紫染色液(C0121)，将细胞小室放入染色5-10分钟。
(e)取出细胞小室，PBS洗涤3次。注：需避免触碰细胞小室底部。
(f)适当风干后，显微镜下观察并计数。Transwell侵袭实验最终染色效果可参考图2。
图2. 碧云天BeyoGold™细胞小室和Matrix-Gel™基质胶(标准型) (C0371/C0372)用于Transwell侵袭实验的效果图。将基质胶1:8稀释，平铺在BeyoGold™细胞小室的上侧，37ºC凝胶2小时后，加培养液水化30分钟，弃上清，在细胞小室中加入约5万个细胞/孔的HCT 116 (人结肠癌细胞)细胞悬液，并把细胞小室浸没在含血清培养液中，培养48小时后经固定、结晶紫染色后的效果。实际效果会因细胞种类、实验条件的不同而存在差异，本图仅供参考。
3.迁移实验：
一般选用5、8μm膜孔径的可允许细胞穿膜的细胞小室，下室为诱导剂，上室接种细胞，经一定时间的培养后，计数进入下室的细胞量可反映细胞响应诱导剂梯度而移动的能力[3]。
a.细胞悬液制备同步骤2b。
b.细胞接种：
(a)取含诱导剂的培养液加入多孔板，用镊子将细胞小室置于多孔板内。
(b)取适量细胞悬液加入细胞小室。
(c)将多孔板置于培养箱中培养24-48小时。注：接种细胞1-2小时后，可对培养板进行检查，确保没有大气泡产生
c.进行相应检测(可参考步骤2d进行)。
4.趋化实验：
一般选用膜孔5、8μm可允许细胞穿膜的细胞小室，下室为诱导剂，上室接种靶细胞，经一定时间的培养后，计数进入下室的细胞量可反映诱导剂对靶细胞的趋化能力。一般趋化作用的研究主要集中于两个方面：效应细胞对靶细胞的趋化作用(即研究效应细胞分泌/代谢产生的物质对靶细胞的趋化作用)和趋化因子对于靶细胞的趋化作用。
a.靶细胞悬液和效应细胞悬液制备同步骤2b。
b.细胞接种：
(a)取适量效应细胞悬液或含趋化因子的培养液加入多孔板，用镊子将细胞小室置于24孔板内。
(b)取适量靶细胞悬液加入细胞小室。
(c)将多孔板置于培养箱中培养24-48小时。注：接种细胞1-2小时后，可对培养板进行检查，确保没有大气泡产生。
c.进行相应检测(可参考步骤2d进行)。
5.细胞间相互作用研究(非趋化作用)：
一般选择0.4、3μm膜孔径的不允许细胞穿膜的细胞小室。一般将效应细胞接种于上室，靶细胞接种于下室，以研究效应细胞分泌或代谢产生的物质对靶细胞的影响。但上、下室的培养液可以交换，接种在上、下室的细胞是相互影响的。接种细胞的位置安排须考虑收集细胞、进行下游检测的方便程度，用户可参考相关文献或进行预实验来最终决定实验方案。
a.靶细胞悬液和效应细胞悬液制备同步骤2b。
b.细胞接种：
(a)取适量靶细胞悬液加入多孔板，用镊子将细胞小室置于多孔板内。
(b)取适量效应细胞悬液加入细胞小室。
(c)将多孔板置于培养箱中培养24-48小时。注：接种细胞1-2小时后，可对培养板进行检查，确保没有大气泡产生。
c.进行相应检测。
常见问题：
1.细胞贴壁生长时的直径可能达20μm，使用8μm孔径小室，细胞能否顺利穿膜？
细胞受到趋化因子的吸引，会挤压自身以穿过膜上的小孔，并非以贴壁生长时的铺展状态穿膜。相反，如果孔径过大，不利于细胞贴壁，也容易使细胞直接落入下室，无法正常进行实验。碧云天BeyoGold™细胞小室系列产品最大孔径为8μm，能够满足大多数较大细胞(如多数肿瘤细胞)穿膜的需求。
2.BeyoGold™细胞小室是否需要搭配特殊的多孔板产品？
不需要，常规的多孔板产品即可。推荐使用碧云天BeyoGold™ 6孔细胞培养板(FCP060)、BeyoGold™ 12孔细胞培养板(FCP126)、BeyoGold™ 24孔细胞培养板(FCP243)。
3.在接种细胞前，BeyoGold™细胞小室是否需要进行预平衡？
大多数应用无需进行预平衡操作，该操作主要适用于基质胶预包被的细胞小室。此外，少数情况下，预平衡可提高细胞的贴壁效率，帮助某些细胞贴壁。预平衡的具体操作为将预热至37ºC的无血清培养液加入多孔板和小室中，然后置于培养箱内平衡至少1小时或过夜。
4.细胞小室的上下室加液量是否有推荐？
小室的上下室加液后液面应基本相平，具体加液体积可参考产品简介部分表2.“碧云天BeyoGold™细胞小室尺寸及推荐加液量表”。
5.在使用基质胶包被或单独加液的上室内，液体是否会很快漏至下室？
一般不会。细胞小室膜孔径有限，在表面张力的作用下，加入上室的试剂并不会很快漏下，如果短时间内发现有液体大量滴下，则提示细胞小室有裂痕或不完整的情况。
6.对细胞小室内接种的细胞进行药物处理时，仅需将药物加至上室吗？
应在上下室内均加入含有同样浓度药物的培养液，以确保药物处理浓度。
参考文献：
1.Justus CR, Marie MA, Sanderlin EJ, Yang LV. Methods Mol Biol. 2023. 2644:349-359.
2.Marshall J. Methods Mol Biol. 2011. 769:97-110.
3.Omar Zaki SS, Kanesan L, Leong MYD, Vidyadaran S. Cell Biol Int. 2019. 43(10):1201-1204.
相关产品：
1.BeyoGold™细胞小室的使用：
a.在细胞小室内接种细胞时，应先将适量预热的培养液加入多孔板的孔中，再用镊子将细胞小室放入相应孔中，在放入时，建议将细胞小室稍稍倾斜，一侧先接触液面，以免垂直放入在小室下生成气泡。最后在细胞小室中进行细胞接种。
注1：推荐的培养液体积请参考表2.“碧云天BeyoGold™细胞小室尺寸及推荐加液量表”。
注2：接种密度对于细胞小室内细胞贴壁和生长情况有一定影响，初次使用时，推荐接种一系列密度梯度的细胞，以确定最佳接种密度。
注3：细胞小室膜孔径大小可直接影响接种细胞的形态和密度。
注4：细胞小室在放置过程中如果有气泡产生，下层培养液的作用就会减弱甚至消失，因此需特别注意。一旦出现气泡，需将小室提起，去除气泡后重新放置。
b.预平衡可以提高细胞的贴壁效率，促进细胞的穿膜。具体操作为将预热至37ºC的无血清培养液加入多孔板和细胞小室中，然后置于培养箱内平衡至少1小时或过夜。平衡完毕后，再进行细胞的接种。
c.上、下室同时接种细胞时，因上、下室培养面积有差异，上室的有效生长面积比下室小，故上室接种的细胞量应少一些。
d.BeyoGold™细胞小室顶部有三个开口以便于用吸头从下部添加或吸取样品。
e.对细胞小室单细胞层进行直接固定和染色：在多孔板中加入一系列固定和染色的溶液，将细胞小室依次浸泡(细胞小室内也需要酌情加入适量的固定和染色溶液)而完成固定和染色的过程。固定和染色后，如有必要可使用解剖刀将膜割下作长期保存。
f.如需从细胞小室中收集细胞，建议同时洗涤细胞小室和培养板，并将分离试剂(胰酶等)同时加在细胞小室中和多孔板孔中，然后按照常规的细胞收集办法进行收集。
2.侵袭实验：
一般选用5、8μm膜孔径的可允许细胞穿膜的细胞小室，下室为诱导剂(Chemoattractants)，上室接种细胞，侵袭实验需要细胞在穿过细胞小室膜的同时，还需要通过穿过涂有基底膜模拟物质(基质胶)的膜表面。本步骤以BeyoGold™细胞小室24孔板套装为例，其它规格多孔板可按比例进行相应试剂用量的调整。
a.基质胶用于细胞小室的包被：
(a)将Matrix-Gel™基质胶(标准型) (C0371/C0372)置于冰中并在4ºC融化，使用预冷的移液管或吸头混合基质胶至均匀状态。
(b)在冰上，将基质胶用无血清培养液按照1:8的比例进行稀释，例如取8µl基质胶加入64µl不含血清的培养液中，使用预冷的吸头混合至均匀状态。注：常用的稀释比例为1:4、1:6、1:8，可根据实验具体情况调整稀释比例。
(c)取60µl上述混合溶液垂直加入细胞小室中，使其均匀平铺在底部，注意均匀铺胶，不要产生气泡。随后置于37ºC孵育3小时。
(d)吸出未结合的基质胶。注：需确保移液管的尖端不会刮伤凝胶层表面。
(e)加入100µl不含血清的培养液，将培养板置于37ºC培养箱孵育30分钟，进行水化。
(f)去除小室中液体，检查是否有液体穿过小室进入到下室中，若没有，则可用于接种细胞。
b.细胞悬液制备：
(a)(选做)对细胞进行12-24小时的饥饿处理。
(b)消化细胞，用不含血清的培养液重悬，调整细胞密度为5-50万个/ml。注：不同细胞的迁移能力不同，可设置一系列细胞密度梯度摸索合适的细胞密度。
c.细胞接种：
(a)取500µl含10% FBS的培养液加入24孔板，用镊子将细胞小室置于24孔板内。
(b)取200µl细胞悬液加入细胞小室。
(c)将24孔板置于培养箱中培养24-48小时。注：接种细胞1-2小时后，可对培养板进行检查，确保没有大气泡产生。
d.细胞固定、染色：
(a)取出细胞小室，去除培养液，用棉签轻轻擦拭基质胶及细胞。
(b)在24孔板干净的孔中加入600µl 4%多聚甲醛固定液(P0099)，将细胞小室放入固定20-30分钟。
(c)弃固定液，PBS洗涤细胞小室1次。注：需避免触碰细胞小室底部。
(d)在24孔板干净的孔中加入适量结晶紫染色液(C0121)，将细胞小室放入染色5-10分钟。
(e)取出细胞小室，PBS洗涤3次。注：需避免触碰细胞小室底部。
(f)适当风干后，显微镜下观察并计数。Transwell侵袭实验最终染色效果可参考图2。
图2. 碧云天BeyoGold™细胞小室和Matrix-Gel™基质胶(标准型) (C0371/C0372)用于Transwell侵袭实验的效果图。将基质胶1:8稀释，平铺在BeyoGold™细胞小室的上侧，37ºC凝胶2小时后，加培养液水化30分钟，弃上清，在细胞小室中加入约5万个细胞/孔的HCT 116 (人结肠癌细胞)细胞悬液，并把细胞小室浸没在含血清培养液中，培养48小时后经固定、结晶紫染色后的效果。实际效果会因细胞种类、实验条件的不同而存在差异，本图仅供参考。3.迁移实验：
一般选用5、8μm膜孔径的可允许细胞穿膜的细胞小室，下室为诱导剂，上室接种细胞，经一定时间的培养后，计数进入下室的细胞量可反映细胞响应诱导剂梯度而移动的能力[3]。
a.细胞悬液制备同步骤2b。
b.细胞接种：
(a)取含诱导剂的培养液加入多孔板，用镊子将细胞小室置于多孔板内。
(b)取适量细胞悬液加入细胞小室。
(c)将多孔板置于培养箱中培养24-48小时。注：接种细胞1-2小时后，可对培养板进行检查，确保没有大气泡产生
c.进行相应检测(可参考步骤2d进行)。
4.趋化实验：
一般选用膜孔5、8μm可允许细胞穿膜的细胞小室，下室为诱导剂，上室接种靶细胞，经一定时间的培养后，计数进入下室的细胞量可反映诱导剂对靶细胞的趋化能力。一般趋化作用的研究主要集中于两个方面：效应细胞对靶细胞的趋化作用(即研究效应细胞分泌/代谢产生的物质对靶细胞的趋化作用)和趋化因子对于靶细胞的趋化作用。
a.靶细胞悬液和效应细胞悬液制备同步骤2b。
b.细胞接种：
(a)取适量效应细胞悬液或含趋化因子的培养液加入多孔板，用镊子将细胞小室置于24孔板内。
(b)取适量靶细胞悬液加入细胞小室。
(c)将多孔板置于培养箱中培养24-48小时。注：接种细胞1-2小时后，可对培养板进行检查，确保没有大气泡产生。
c.进行相应检测(可参考步骤2d进行)。
5.细胞间相互作用研究(非趋化作用)：
一般选择0.4、3μm膜孔径的不允许细胞穿膜的细胞小室。一般将效应细胞接种于上室，靶细胞接种于下室，以研究效应细胞分泌或代谢产生的物质对靶细胞的影响。但上、下室的培养液可以交换，接种在上、下室的细胞是相互影响的。接种细胞的位置安排须考虑收集细胞、进行下游检测的方便程度，用户可参考相关文献或进行预实验来最终决定实验方案。
a.靶细胞悬液和效应细胞悬液制备同步骤2b。
b.细胞接种：
(a)取适量靶细胞悬液加入多孔板，用镊子将细胞小室置于多孔板内。
(b)取适量效应细胞悬液加入细胞小室。
(c)将多孔板置于培养箱中培养24-48小时。注：接种细胞1-2小时后，可对培养板进行检查，确保没有大气泡产生。
c.进行相应检测。
常见问题：
1.细胞贴壁生长时的直径可能达20μm，使用8μm孔径小室，细胞能否顺利穿膜？
细胞受到趋化因子的吸引，会挤压自身以穿过膜上的小孔，并非以贴壁生长时的铺展状态穿膜。相反，如果孔径过大，不利于细胞贴壁，也容易使细胞直接落入下室，无法正常进行实验。碧云天BeyoGold™细胞小室系列产品最大孔径为8μm，能够满足大多数较大细胞(如多数肿瘤细胞)穿膜的需求。
2.BeyoGold™细胞小室是否需要搭配特殊的多孔板产品？
不需要，常规的多孔板产品即可。推荐使用碧云天BeyoGold™ 6孔细胞培养板(FCP060)、BeyoGold™ 12孔细胞培养板(FCP126)、BeyoGold™ 24孔细胞培养板(FCP243)。
3.在接种细胞前，BeyoGold™细胞小室是否需要进行预平衡？
大多数应用无需进行预平衡操作，该操作主要适用于基质胶预包被的细胞小室。此外，少数情况下，预平衡可提高细胞的贴壁效率，帮助某些细胞贴壁。预平衡的具体操作为将预热至37ºC的无血清培养液加入多孔板和小室中，然后置于培养箱内平衡至少1小时或过夜。
4.细胞小室的上下室加液量是否有推荐？
小室的上下室加液后液面应基本相平，具体加液体积可参考产品简介部分表2.“碧云天BeyoGold™细胞小室尺寸及推荐加液量表”。
5.在使用基质胶包被或单独加液的上室内，液体是否会很快漏至下室？
一般不会。细胞小室膜孔径有限，在表面张力的作用下，加入上室的试剂并不会很快漏下，如果短时间内发现有液体大量滴下，则提示细胞小室有裂痕或不完整的情况。
6.对细胞小室内接种的细胞进行药物处理时，仅需将药物加至上室吗？
应在上下室内均加入含有同样浓度药物的培养液，以确保药物处理浓度。
参考文献：
1.Justus CR, Marie MA, Sanderlin EJ, Yang LV. Methods Mol Biol. 2023. 2644:349-359.
2.Marshall J. Methods Mol Biol. 2011. 769:97-110.
3.Omar Zaki SS, Kanesan L, Leong MYD, Vidyadaran S. Cell Biol Int. 2019. 43(10):1201-1204.
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