使用说明：
1. DNA样品的定量。
因为Tn5 Transposome用量与DNA起始量密切相关，所以准确测定DNA浓度是实验的关键。纯化过的DNA样品溶于超纯水或10mM Tris-HCl (pH8.0)中，吸光度OD
260/OD
280应在1.8-2.0之间，并且DNA样品不含酚、乙醇等有机物的污染或超过1mM的EDTA，否则会影响DNA片段化和接头连接。推荐使用基于特异结合dsDNA的荧光染料法进行浓度测定，如Qubit荧光定量平台或PicoGreen荧光染料试剂盒。不推荐使用以紫外吸光度为基础的测定方法(如NanoDrop)，潜在污染的RNA或蛋白会干扰紫外吸光度的检测。
2. DNA片段化与接头连接。
a. 室温融解Reaction Buffer (5X)和Stop Buffer (5X)，轻轻混匀。
b. 按照下表依次添加各反应组分，轻轻吹打并确保充分混匀。如果样品数量比较多，可以将下表中样品之外的3种溶液预混合。
| Components |
Volume |
| DNA Sample |
xμl (1-100ng) |
| Ultrapure Water |
(15-x)μl |
| Reaction Buffer (5X) |
4μl |
| BeyoNGS™ Tn5 Transposome (20μM) |
1μl |
c. 按照如下程序在PCR仪上进行DNA片段化与接头连接反应。可根据DNA样品量和所需片段大小适当调整55ºC的反应时间。
| Step |
Temperature |
| 1 |
55ºC, 5-10min |
| 2 |
10ºC, 10min |
d. 从PCR仪中取出样品，加入5μl Stop Buffer (5X)，轻轻吹打混匀后再次放回PCR仪中，55ºC孵育5min以终止反应。此时获得的为 DNA片段与接头的连接产物(DNA fragments with adapters)。
3. PCR扩增适用于Illumina二代测序平台的DNA文库。
a. 按照下表依次添加各反应组分，轻轻吹打混匀。
| Components |
Volume |
| DNA fragments with adapters |
24μl |
| i5 primer (10μM) |
0.5μl |
| i7 primer (10μM) |
0.5μl |
| BeyoNGS™ PCR Master Mix (2X) |
25μl |
| Total Volume |
50μl |
b. 将样品置于PCR仪中，反应程序设置如下。
| Step |
Temperature |
Time |
Cycles |
| 1 |
68ºC |
3min |
1 |
| 2 |
92ºC |
3min |
1 |
| 3 |
92ºC |
30s |
4-14* |
| 4 |
68ºC |
90s |
| 5 |
68ºC |
10min |
1 |
| 6 |
4ºC |
- |
- |
注：Step1, 68ºC, 3min该步骤的目的是为了补平DNA文库末端缺口，此步骤不可省略。
* PCR循环数越多则DNA文库产量越高，但重复DNA文库数量也会增加，请根据测序需要选择适当的PCR循环数。不同起始DNA样品用量和不同循环数对应的DNA文库扩增后的大致产量参照下表：
| DNA Sample |
Cycles |
| 1ng |
11 |
12 |
13 |
14 |
| 5ng |
8 |
9 |
10 |
11 |
| 20ng |
6 |
7 |
8 |
9 |
| 50ng |
4 |
5 |
6 |
7 |
| PCR Products (ng) |
400 |
600 |
1000 |
1500 |
4. 磁珠分选特定长度的DNA文库。推荐使用BeyoMag™ DNA长度分选磁珠(
D0038)或BeyoMag™ II DNA长度分选磁珠(
D0039)的产品说明书或其它适当的DNA长度分选磁珠根据实验需要进行单侧或双侧的长度分选。具体的长度分选操作，请参考相应的产品说明书。自行制备的进行长度分选后的DNA文库就可以用于后续的高通量测序了。
参考文献：
1. Slatko BE, Gardner AF, Ausubel FM. Curr Protoc Mol Biol. 2018. 122(1):e59.
2. Picelli S, Björklund AK, Reinius B, Sagasser S, Winberg G, Sandberg R. Genome Res. 2014. 24(12):2033-40.
3. Bjornson M, Kajala K, Zipfel C, Ding P. Bio Protoc. 2020. 10(20):e3799.
4. Brouilette S, Kuersten S, Mein C, Bozek M, Terry A, Dias KR, et al. Dev Dyn. 2012. 241(10):1584-90.
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BeyoMag™ DNA长度分选磁珠 |
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