使用说明：
1.样品的准备。
a.在适当的条件下培养所需细胞，当细胞密度达70%-80%时(处于对数生长期)，加入不含外泌体的血清培养液或适当的无血清培养液，继续培养12-24小时，待细胞密度达90%-100%时，收集细胞上清。
注1：由于血清中含有非常多的外泌体，为了避免污染，此时需要加入不含外泌体的血清。不含外泌体的血清可以通过超速离心法获得，也可以直接使用无外泌体的血清。也可以根据具体的实验条件，使用不含血清的培养液进行培养，某些细胞可无血清正常生长约12个小时，或者增加不含细胞的培养液组作为阴性对照。
注2：细胞上清中外泌体的量随细胞类型、细胞状态和细胞数量的差别而有一定的差异，须根据实验需求决定样品的起始量。
注3：细胞凋亡、死亡过程中会释放大量囊泡，这些囊泡在外泌体的提取纯化过程中会污染活细胞产生的外泌体，请确保细胞状态良好，凋亡或死亡细胞占比尽量不超过5%。
b.将收集的细胞培养液在4ºC，500×g离心5分钟，轻轻缓慢地吸取上清液至一新的离心管中；再将上清液在4ºC，10,000-16,500×g离心30分钟，轻轻缓慢地吸取上清液至一新的离心管中。
c.用0.22m的针头滤器(
FF342/
FF362/
FF372)过滤上清液，进一步去掉较大的细胞囊泡和凋亡小体等杂质，将过滤后的上清液转移至新的离心管中。
d.选做：使用10-100kDa之间的超滤管(如
FUF158)对上清液进行浓缩。将浓缩后的上清液从超滤管的死体积收集器中取出，用于后续外泌体提取。
注：一些细胞(干细胞、神经细胞)分泌的外泌体较少，可以将细胞上清液体积浓缩10倍左右再进行后续的外泌体提取；而对于外泌体分泌量多的肿瘤细胞等，可以不进行浓缩或将细胞上清液体积浓缩2-5倍左右在进行后续的外泌体提取。具体浓缩倍数可根据实际情况进行调整。
2.外泌体提取。
a.每1ml步骤1中准备好的上清液样品中加入190μl的BeyoExo™增强型细胞上清外泌体提取试剂，吹打混匀后置于4ºC，静置2-4小时或者过夜。
注：BeyoExo™增强型细胞上清外泌体提取试剂非常粘稠，需缓慢吸取，缓慢加入，并确保外泌体提取试剂与细胞上清液充分混匀。如果细胞分泌的外泌体较少，则可以通过增加静置的时间或者增加样本量以提高外泌体得率。
b.10,000×g在4ºC离心30分钟，用1ml吸头小心吸除上清液，尽可能吸净上清液但不要触碰沉淀，收集沉淀，即为外泌体。
注：细胞培养液样品中外泌体一般含量较少，此时可能肉眼观察不到沉淀，如果离心时使用角转子，注意标记离心管摆放方向，并在底部位置画圈标识。
c.离心获得的外泌体沉淀可用适量的PBS或者生理盐水重悬，一般10ml细胞培养液的起始量使用0.1-1ml重悬液进行重悬；也可直接将沉淀用于后续实验。
注：外泌体可在4ºC保存1周，或在-20ºC及更低温度长期保存。
d.选做：某些样品中的非外泌体杂质较多，导致沉淀比较多，此时可通过重悬并短暂离心去除杂质。将沉淀用适量的PBS重悬，然后12,000×g在4ºC离心2分钟，取上清。若沉淀较多，可将上清多次12,000×g在4ºC离心2分钟，直至无明显沉淀。
注1：沉淀可能较难重悬，需反复多次吹打。
注2：需根据后续的纯化方法选择合适的重悬液。
3.外泌体纯化(可选)。
a.获得的外泌体可通过外泌体纯化柱或亲和层析法等方法进一步进行纯化。
b.若需要获得无菌的外泌体，则可使用0.22m的针头滤器进行过滤。为减少损失，请先将滤器用PBS进行润洗。若提取的外泌体暂时不使用，可进行分装后于-80ºC保存。
4.外泌体裂解(可选)。
获得的外泌体重悬液或沉淀可以使用BeyoExo™外泌体专用裂解液(
C3632)裂解后进行蛋白浓度测定或进行Western等后续实验。具体可参考BeyoExo™外泌体专用裂解液(
C3632)的使用说明。
参考文献：
1.Metzelaar MJ, Wijngaard PL, Peters PJ, Sixma JJ, Nieuwenhuis HK, et al. J Biol Chem. 1991. 15;266(5):3239-45.
2.Luo W, Dai Y, Chen Z, Yue X, Andrade-Powell KC, et al. Commun Biol. 2020. 10;3(1):114.
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6.Stam J, Bartel S, Bischoff R, Wolters JC. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2021. 1169:122604.
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