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NADP+/NADPH检测试剂盒(WST-8法)
产品编号: S0179
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价格:¥1386.00元
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S0179 NADP+/NADPH检测试剂盒(WST-8法) 100次 1386.00元

碧云天的NADP+/NADPH检测试剂盒(WST-8法) (NADP+/NADPH Assay Kit with WST-8)是一种基于WST-8的显色反应,通过比色法来检测细胞、组织或其它样品中NADP+ (氧化型辅酶II)和NADPH (还原型辅酶II)各自的量、比值和总量的检测试剂盒。
NADP+/NADPH以及NAD+/NADH的传统检测方法是检测NADPH或者NADH在340nm处吸收波长的变化,该方法灵敏度较低并易受样品中有类似紫外吸收物质的干扰,并且在紫外检测过程中通常需要加大检测样品量以弥补NADPH在340nm处吸光度过小的不足,因此该检测方法具有很大的局限性。
WST-8是MTT的一种升级替代产品,和MTT或其它MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点。首先,MTT被一些脱氢酶还原生成的formazan不是水溶性的,需要有特定的溶液来溶解;而WST-8和XTT、MTS产生的formazan都是水溶性的,可以省去后续的溶解步骤。其次,WST-8产生的formazan比XTT和MTS产生的formazan更易溶解。再次,WST-8比XTT和MTS更加稳定,使实验结果更加稳定。另外,WST-8和MTT、XTT等相比,线性范围更宽,灵敏度更高。
WST-8和WST-1相比,检测灵敏度更高,更易溶解,并且更加稳定。
本试剂盒使用便捷,无需分离纯化细胞、组织或其它样品中的NADP+和NADPH,且特异性检测NADP+和NADPH,而不检测NAD+和NADH。本试剂盒可以检测含量低至0.05μM (2.5pmol)的NADP+或NADPH,在0.05μM (2.5pmol)至6μM (300pmol)之间呈现良好的线性关系。
NADP (Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)是很多氧化还原反应的辅酶,包括NADP+ (氧化型)和NADPH (还原型)两种形式。NADP+也参与到生物合成反应中,比如脂质和核酸的合成。在动物细胞中,戊糖磷酸途径(pentose phosphate pathway,PPP)的氧化阶段是NADPH最主要的来源。
本试剂盒可检测样品中的NADP+、NADPH以及它们的比值,具体原理如下:

a. 测定NADP+/NADPH的总量:葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate, G6P)在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH)的作用下氧化生成6-磷酸葡萄糖酸内酯(6-phosphogluconate,6-PG),在这一反应过程中NADP+被还原为NADPH;生成的NADPH在电子耦合试剂1-mPMS (1-Methoxy-5-methylphenazinium Methyl Sulfate)的作用下将WST-8还原生成橙黄色的formazan,在450nm左右检测有最大吸收峰。反应体系中生成的formazan与样品中总的NADP+/NADPH的总量呈比例关系。WST-8法检测NADP+和NADPH总量的原理参考图1。
b. 单独测定NADPH的量:60℃水浴加热30分钟后,样品中NADP+会分解而只保留NADPH。NADPH将WST-8还原成formazan,通过比色法确定反应生成的formazan的量,最终可以确定样品中NADPH的量。
c. 测定NADP+以及NADP+/NADPH比值:根据前两步检测获得的NADP+和NADPH总量以及NADPH的量,即可得到样品中NADP+的量以及NADP+/NADPH的比值。


图1. WST-8法检测NADP+和NADPH总量的原理图。

本试剂盒适用于检测细胞、组织以及其它适当样品中的NADP+和NADPH各自的量、比值和总量。

当仅检测NADP+和NADPH的总量或者样品中的NADPH的量时,一个本试剂盒可以进行100次检测;当检测NADP+或者NADP+/NADPH的比值时,一个本试剂盒可以进行50次检测。 包装清单:


产品编号 产品名称 包装
S0179-1 G6PDH 220μl
S0179-2 显色液 1.1ml
S0179-3 NADPH 5mg
S0179-4 NADP+/NADPH提取液 50ml
S0179-5 反应缓冲液 11ml
说明书 1份

保存条件:
-20℃保存,一年有效。显色液(S0179-2)和NADPH (S0179-3)须-20℃避光保存。NADPH配制成溶液后,须适当分装后-80℃保存。所有试剂避免反复冻融。
注意事项:
本试剂盒中的所有试剂均需要冷冻保存,请严格按照保存条件进行保存。如果不是一次用完,为避免反复冻融导致产品失效,请适当分装后保存。
NADPH不太稳定,取出NADPH后请尽快使用。如果发现标准曲线不理想,很有可能是标准品发生了降解。
由于NADP+/NADPH提取液本身比较粘稠,以该提取液作为稀释液时,无论对标准品还是样品进行稀释,在稀释过程中务必保证稀释均匀,否则易造成实验数据产生较大波动。
在样品加样和混匀过程中,须尽量避免产生气泡,以免影响最终的吸光度测定。
如果不能非常严格地控制反应温度和反应时间,每次检测都需要设置标准曲线。
如果样品溶液中NADP+和NADPH浓度过高或过低,不在试剂盒的线性检测范围内时,可适当调整样品或者提取液的用量。
由于NADP+和NADPH很不稳定,在冻存过程中较易降解,所以宜尽量使用新鲜样品进行检测。
本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1. 样品的准备:
a. 细胞样品的准备:对于贴壁细胞,约1×106个细胞(大约相当于6孔板一个孔长满的细胞数量),吸净培养液,用移液器加入200μl的NADP+/NADPH提取液,并轻轻吹打,以促进细胞的裂解;对于悬浮细胞,约1×106个细胞,600g离心5分钟,吸净培养液,用移液器加入200μl冰浴预冷的NADP+/NADPH提取液,并轻轻吹打,以促进细胞的裂解;裂解过程在室温或冰上操作均可。随后12,000g,4℃离心5-10分钟,取上清作为待测样品备用。
b. 组织样品的准备:冰上预冷的PBS洗涤组织后,称取约10-30mg的组织样品,用剪刀剪碎,置于匀浆器中,加入400μl的NADP+/NADPH提取液在室温或冰上进行匀浆。随后12,000g,4℃离心5-10分钟,取上清作为待测样品备用。
2. 试剂盒的准备工作:
a. NADPH标准品的配制:吸取6ml超纯水充分溶解本试剂盒提供的5mg NADPH后即得到1mM NADPH标准品。1mM NADPH标准品请适当分装后-80℃避光保存。
b. NADPH标准曲线的设置:把1mM的NADPH标准品用NADP+/NADPH提取液稀释成适当的浓度梯度,如初次检测可以设置0、0.25、0.5、1、2、4、6、8μM这几个浓度,检测时96孔板每孔加入50μl的标准品,相当于每孔为0、12.5、25、50、100、200、300、400pmol的NADPH。如有必要,在后续的实验中可以根据样品中的NADPH含量对标准品的浓度范围进行适当调整。其中浓度为0μM的点为空白对照点,仅含NADP+/NADPH提取液。注意:由于NADPH很不稳定,故配制后需尽快使用。
c. G6PDH工作液的配制:将G6PDH用反应缓冲液稀释50倍,例如2μl G6PDH加入到98μl的反应缓冲液中,即可获得100μl的G6PDH工作液。每个标准品或样品的检测需要使用100μl的G6PDH工作液,请根据所需检测的标准品和样品的数量,配制适量的G6PDH工作液,并注意现配现用。
3. 样品测定:
a. 样品中NADP+和NADPH总量的测定:吸取50μl待测样品至96孔板中,为了减少实验误差请设置样品的重复孔。后续如果发现样品中的NADP+和NADPH的总量过高,超出标准曲线的范围,则需要用NADP+/NADPH提取液将样品适当稀释后再进行检测;总量过低时则需要加大细胞或组织样品的用量。
b. 样品中NADP+、NADPH的含量或者NADP+/NADPH比值的测定:吸取100-200μl待测样品于离心管中,60℃水浴或PCR仪上加热30分钟以分解NADP+。如果加热后产生不溶物,则需10,000g,室温或4℃离心5分钟,吸取50μl上清液作为待测样品至96孔板中,为了减少实验误差建议设置样品的重复孔。后续如果发现样品中的NADP+或NADPH的含量过高,超出标准曲线的范围,则需要用NADP+/NADPH提取液将样品适当稀释后再进行检测;含量过低时则需要加大细胞或组织样品的用量。
c. 请参考下表使用96孔板设置空白对照孔、标准品孔和样品孔。加入G6PDH工作液后充分混匀。

空白对照(Blank) 标准品(Standard) 样品(Sample)
待测样品 50μl 50μl
NADP+/NADPH提取液 50μl
G6PDH工作液 100μl 100μl 100μl

d. 37℃避光孵育10分钟。说明:此孵育步骤的目的是将样品中的NADP+转化为NADPH;在加入G6PDH工作液过程中须轻柔操作,以免产生气泡。若不慎出现气泡,可使用细小的吸头或针头戳破。
e. 每孔加入10μl显色液,混匀,37℃避光孵育10-20分钟,此时会形成橙黄色的formazan。测量450nm处的吸光度。如果显色较浅,也可以适当延长孵育时间至30-60分钟,随着孵育时间延长,显色会逐渐加深。
4. 样品中NADP+/NADPH量的计算:
a. 计算标准品组中每个点的平均吸光度,减去空白对照组的吸光度,即为各个标准品的吸光度。
b. 以NADPH的浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制出标准曲线。NADPH标准品的检测效果请参考图2。如果孵育时间过长,高浓度标准品的显色会达到平台,此时宜选择未达到平台的标准品来绘制标准曲线,或者选择孵育时间较短的标准品吸光度数据来绘制标准曲线。

图2. NADPH的标准曲线。上图显示本试剂盒可以很好地检测出NADPH的含量,并且不会受NADH的干扰。不同的检测条件下,实际读数会因标准品的配制、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。

c. 根据标准曲线计算细胞、组织等样品中的NADP+和NADPH总浓度或者NADPH的浓度。未60℃加热处理时,计算得到的是样品中NADP+和NADPH总量的浓度(NADPtotal);60℃加热处理后,检测得到的是样品中NADPH的浓度。
备注:根据检测得到的浓度及样品的体积,即可计算出NADP+、NADPH、NADPtotal的量。
d. 根据如下计算公式,计算样品中NADP+的量以及NADP+/NADPH的比值。此时可以把NADP+和NADPH总量或各自的含量用单位细胞数量或单位组织重量中的含量来表示。
  [NADP+] = [NADPtotal] - [NADPH]
  [NADP+]/[NADPH] = ([NADPtotal] - [NADPH])/[NADPH]
e. 如果希望更加精确地来表述NADP+和NADPH总量或各自的含量,可以将样品用BCA法测定蛋白浓度。最终用单位蛋白量中NADP+和NADPH总量或各自的含量来比较精确地进行表述。

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使用本产品的文献:
1. Ma Y,Qi Y,Wang L,Zheng Z,Zhang Y,Zheng J
Free Radic Biol Med. 2019 Apr;134:458-467.
2. Xie GH,Dai HJ,Liu F,Zhang YP,Zhu L,Nie JJ,Wu JH
Cell Mol Neurobiol. 2019 Dec 16; (IF 3.606)
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