使用说明：
1.准备工作。
a.将要标记的生物大分子溶解在Conjugation Buffer中，使终浓度约为0.5-5mg/ml。如果溶液里有额外的伯胺(如Tris或Glycine)或者铵离子，推荐使用碧云天脱盐柱(P2603/P2605/P2607/P2613/P2615/P2617)进行脱盐处理。
b.13.33mg/ml SATA的配制：将交联剂SATA平衡至室温再开瓶。称量适量的SATA，用试剂盒中的提供的无水溶剂，按照每1mg SATA使用75µl无水溶剂的比例进行溶解。如果短期内全部使用完毕，可以使用试剂盒中提供的全部的无水溶剂溶解全部的SATA，充分溶解后即为13.33mg/ml SATA，例如小包装中的2mg SATA用150μl无水溶剂进行溶解。如不立即使用，可分装后-20ºC保存，两个月内有效。
2.确认反应比例。需根据蛋白的浓度，参考下表中的推荐比例进行标记反应，通常能在每个蛋白分子上标记1-6个巯基。如果标记效率不理想，可酌情提高SATA的比例。

Sample Type	Sample Concentration	Recommended Molar Excess
IgG antibody	1mg/ml	~25X
Purified protein	2mg/ml or lower	~15-40X
Purified protein	>2mg/ml	~10X

3.小量样品(不超过130µl)的巯基标记反应。
以下以IgG作为样品(MW 150kDa)，体积为0.1ml为例，其它样品体积可按比例调整。不同分子量的样品需根据推荐的反应比例进行调整。
a.将需要标记的0.1ml样品转移到洁净的1.5ml离心管(FTUB306)，样品应该已经溶解于Conjugation Buffer中。
b.根据样品浓度，参考下表计算加入13.33mg/ml SATA的体积，加入后立即轻柔涡旋混匀。

Concentration of Biomolecule Solution	Volume of Biomolecule Solution	Volume of SATA Solution	Molar Excess
0.5mg/ml	0.1ml	0.24µl	~40X
1.0mg/ml	0.1ml	0.3µl	~25X
2.0mg/ml	0.1ml	0.35µl	~15X
5.0mg/ml	0.1ml	0.58µl	~10X

c.在室温(约25ºC)反应30分钟或者4ºC反应2小时，反应过程推荐在翘板摇床(也称侧摆摇床)上进行。推荐使用BeyoShaker™数字式翘板摇床(E6673)。也可以使用LCD数控型长轴旋转混匀仪(E1505)，推荐的速度为25rpm上下翻转。
注：反应结束后，标记了SATA的样品可以置于-20ºC进行储存，直到需要进行接下来的交联反应时取出，平衡至室温。
d.巯基的脱保护：
(a)50mg/ml Hydroxylamine Solution的配制：将Hydroxylamine平衡至室温再开瓶。称量适量的Hydroxylamine，用试剂盒中提供的Deprotection Buffer进行溶解配制成50mg/ml Hydroxylamine Solution。注：Hydroxylamine Solution须现配现用。
(b)按照步骤3b/c中反应体积的1/10加入Hydroxylamine Solution。例如，反应体积为0.1ml，需加入10µl Hydroxylamine Solution，轻微涡旋混合，并快速离心一下以沉淀液体。
(c)在室温(约25ºC)反应2小时，反应过程推荐在翘板摇床(也称侧摆摇床)上进行。推荐使用BeyoShaker™数字式翘板摇床(E6673)。也可以使用LCD数控型长轴旋转混匀仪(E1505)，推荐的速度为25rpm上下翻转。
注：反应进行时，可提前进行脱盐柱的准备，时长大约为10-15分钟。
e.脱盐柱的准备：移去脱盐柱Desalting Column (5kDa MWCO, 0.5ml)的下堵头，置于1.5ml离心管或2ml洗脱管中，1,000×g离心1分钟，丢弃脱盐柱离心下来的保存溶液，并重新把脱盐柱放回离心管中。使用非水平转头的情况下，由于离心会使树脂压实形成一个向上的斜面，该斜面的方向宜在后续步骤中保持，所以在脱盐柱外壳上的斜面向上位置做标记，在随后的离心步骤中需要调整好离心管的放入方向，确保离心后斜面的方向和位置不会改变。
f.脱盐柱的预平衡：
(a)准备脱盐柱平衡液：取一定体积的Conjugation Buffer，向其中加入1/10体积的Deprotection Buffer，作为脱盐柱的平衡液。
(b)向脱盐柱树脂顶部加入0.5ml脱盐柱平衡液以平衡脱盐柱，1,000×g离心1分钟，丢弃溶液，重复本步骤2-3次。
g.上样：将脱盐柱放入新的1.5ml离心管中，把步骤3d的样品(不能超过130µl)加入到树脂的中心位置，使树脂吸入样品。
注：样品体积不要超过脱盐柱规定的样品量体积，否则会降低样品回收率。
h.洗脱：将脱盐柱1,000×g离心2分钟，流穿液含有纯化的巯基标记的生物大分子。
注：脱盐柱不适合重复使用。
i.立即进行下一步与带马来酰亚胺蛋白(本试剂盒不提供)的交联反应。
4.中量样品(不超过0.5ml)的巯基标记反应。
以下以IgG作为样品(MW 150kDa)，体积为0.5ml为例，其它样品体积可按比例调整。不同分子量的样品需根据推荐的反应比例进行调整。
a.将需要标记的0.5ml样品转移到洁净的1.5ml离心管(FTUB306)，样品应该已经溶解于Conjugation Buffer中。
b.根据样品浓度，参考下表计算加入13.33mg/ml SATA的体积，加入后立即轻柔涡旋混匀。

Concentration of Biomolecule Solution	Volume of Biomolecule Solution	Volume of SATA Solution	Molar Excess
0.5mg/ml	0.5ml	1.2µl	~40X
1.0mg/ml	0.5ml	1.5µl	~25X
2.0mg/ml	0.5ml	1.75µl	~15X
5.0mg/ml	0.5ml	2.9µl	~10X

c.在室温(约25ºC)反应30分钟或者4ºC反应2小时，反应过程推荐在翘板摇床(也称侧摆摇床)上进行。推荐使用BeyoShaker™数字式翘板摇床(E6673)。也可以使用LCD数控型长轴旋转混匀仪(E1505)，推荐的速度为25rpm上下翻转。
注：反应结束后，标记了SATA的样品可以置于-20ºC进行储存，直到需要进行接下来的交联反应时取出，平衡至室温。
d.巯基的脱保护：
(a)50mg/ml Hydroxylamine Solution的配制：将Hydroxylamine平衡至室温再开瓶。称量适量的Hydroxylamine，用试剂盒中提供的Deprotection Buffer进行溶解配制成50mg/ml Hydroxylamine Solution。注：Hydroxylamine Solution须现配现用。
(b)按照步骤4b/c中反应体积的1/10加入Hydroxylamine Solution。例如，反应体积为0.5ml，需加入50µl Hydroxylamine Solution，轻微涡旋混合。
(c)在室温(约25ºC)反应2小时，反应过程推荐在翘板摇床(也称侧摆摇床)上进行。推荐使用BeyoShaker™数字式翘板摇床(E6673)。也可以使用LCD数控型长轴旋转混匀仪(E1505)，推荐的速度为25rpm上下翻转。
注：反应进行时，可提前进行脱盐柱的准备，时长大约为10-15分钟。
e.脱盐柱的准备：移去脱盐柱Desalting Column (5kDa MWCO, 2ml)的下堵头，置于15ml离心管中，1,000×g离心2分钟，丢弃脱盐柱离心下来的保存溶液，并重新把脱盐柱放回离心管中。使用非水平转头的情况下，由于离心会使树脂压实形成一个向上的斜面，该斜面的方向宜在后续步骤中保持，所以在脱盐柱外壳上的斜面向上位置做标记，在随后的离心步骤中需要调整好离心管的放入方向，确保离心后斜面的方向和位置不会改变。
f.脱盐柱的预平衡：
(a)准备脱盐柱平衡液：取一定体积的Conjugation Buffer，向其中加入1/10体积的Deprotection Buffer，作为脱盐柱的平衡液。
(b)向脱盐柱的树脂顶部加入1.5ml脱盐柱平衡液以平衡脱盐柱，1,000×g离心2分钟，丢弃溶液，重复本步骤2-3次。
g.上样：将脱盐柱放入新的15ml离心管中，把步骤4d的样品(不能超过0.5ml)加入到树脂的中心位置，使树脂吸入样品。
注：如果样品体积<400µl，在树脂吸入样品后再加入100µl超纯水可以增加样品回收率，但同时会稀释标记样品的浓度。
h.洗脱：将脱盐柱1,000×g离心2分钟，流穿液含有纯化的巯基标记的生物大分子。
注：脱盐柱不适合重复使用。
i.立即进行下一步与带马来酰亚胺蛋白(本试剂盒不提供)的交联反应。
5.大量样品(不超过2.5ml)的巯基标记反应。
以下以IgG作为样品(MW 150kDa)，体积为2ml为例，其它样品体积可按比例调整。不同分子量的样品需根据推荐的反应比例进行调整。
a.将需要标记的2ml生物大分子转移到洁净的15ml离心管(FTUB515)，样品应该已经溶解于Conjugation Buffer中。
b.根据样品浓度，参照下表计算加入10mg/ml Sulfo-SMCC的体积，加入后立即轻柔涡旋混匀。

Concentration of Biomolecule Solution	Volume of Biomolecule Solution	Volume of SATA Solution	Molar Excess
0.5mg/ml	2ml	4.8µl	~40X
1.0mg/ml	2ml	6.0µl	~25X
2.0mg/ml	2ml	7.0µl	~15X
5.0mg/ml	2ml	11.6µl	~10X

c.在室温(约25ºC)反应30分钟或者4ºC反应2小时，反应过程推荐在翘板摇床(也称侧摆摇床)上进行。推荐使用BeyoShaker™数字式翘板摇床(E6673)。也可以使用LCD数控型长轴旋转混匀仪(E1505)，推荐的速度为25rpm上下翻转。
注：反应结束后，标记了SATA的样品可以置于-20ºC进行储存，直到需要进行接下来的交联反应时取出，平衡至室温。
d.巯基的脱保护：
(a)50mg/ml Hydroxylamine Solution的配制：将Hydroxylamine平衡至室温再开瓶。称量适量的Hydroxylamine，用试剂盒中提供的Deprotection Buffer进行溶解配制成50mg/ml Hydroxylamine Solution。
注：Hydroxylamine Solution须现配现用。
(b)按照步骤5b/c中反应体积的1/10加入Hydroxylamine Solution。例如，反应体积为2ml，需加入200µl Hydroxylamine Solution，轻微涡旋混合。
(c)在室温(约25ºC)反应2小时，反应过程推荐在翘板摇床(也称侧摆摇床)上进行。推荐使用BeyoShaker™数字式翘板摇床(E6673)。也可以使用LCD数控型长轴旋转混匀仪(E1505)，推荐的速度为25rpm上下翻转。
注：反应进行时，可提前进行脱盐柱的准备，时长大约为10-15分钟。
e.脱盐柱的准备：移去脱盐柱Desalting Column (5kDa MWCO, 8ml)的下堵头，置于50ml离心管中，1,000×g离心2分钟，丢弃脱盐柱离心下来的保存溶液，并重新把脱盐柱放回离心管中。使用非水平转头的情况下，由于离心会使树脂压实形成一个向上的斜面，该斜面的方向宜在后续步骤中保持，所以在脱盐柱外壳上的斜面向上位置做标记，在随后的离心步骤中需要调整好离心管的放入方向，确保离心后斜面的方向和位置不会改变。注：脱盐柱(5kDa MWCO, 8ml)放入50ml离心管内进行离心时，需要使用相应的适配器(Adaptor)，如12ml层析柱转50ml离心管适配器(FSA013)。
f.脱盐柱的预平衡：
(a)准备脱盐柱平衡液：取一定体积的Conjugation Buffer，向其中加入1/10体积的Deprotection Buffer，作为脱盐柱的平衡液。
(b)向脱盐柱的树脂顶部加入5ml脱盐柱平衡液以平衡脱盐柱，1,000×g离心2分钟，丢弃溶液，重复本步骤2-3次。
g.上样：将脱盐柱放入新的50ml离心管中，把步骤5d的样品(不能超过2.5ml)加入到树脂的中心位置，使树脂吸入样品。
注：如果样品体积<1.8ml，在树脂吸入样品后再加入200µl超纯水可以增加样品回收率，但同时会稀释标记样品的浓度。
h.洗脱：将脱盐柱1,000×g离心2分钟，流穿液含有纯化的巯基标记的生物大分子。
注：脱盐柱不适合重复使用。
i.立即进行下一步与带马来酰亚胺蛋白(本试剂盒不提供)的交联反应。
6.(选做)巯基修饰的蛋白与带马来酰亚胺蛋白的交联反应。
a.立即将步骤3h/4h/5h中纯化后的巯基修饰蛋白与带马来酰亚胺的蛋白按照所需比例混合。反应比例可根据最终交联物所需的摩尔比以及两种蛋白上的巯基和马来酰亚胺的相对数量来进行计算和优化。
b.室温下孵育30分钟，或4ºC孵育2小时。
注1：通常在交联反应体系中补加1-5mM EDTA，能有效避免带巯基的蛋白自身反应形成二硫键。
注2：交联反应虽然在一定时间内就能完成，延长反应时间至数小时或过夜通常没有影响。如需提前终止交联反应，可向反应溶液中加入L-半胱氨酸溶液，终浓度需为反应体系中带巯基蛋白浓度的数倍。
注3：如需对另一蛋白进行马来酰亚胺的修饰，可使用碧云天的Maleimide快速标记试剂盒(P1291)。
参考文献：
1.Duncan RJ, Weston PD, Wrigglesworth R. Anal Biochem. 1983. 132(1):68-73.
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