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INHBA基因敲除质粒
产品编号: L00296
产品包装:5µg
价格: ¥ 999.00
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产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
L00296 INHBA基因敲除质粒 5µg 999.00元
L00297 INHBA基因敲除慢病毒 10^8 TU 6999.00元
L00298 INHBA基因敲除HEK293T细胞 1支/瓶 7999.00元
L00299 INHBA基因敲除HEK293T细胞RIPA裂解液 100µg 1258.00元
L00300 INHBA基因敲除HEK293T细胞Trizol裂解液 500µl 1258.00元

pLenti-INHBA-sgRNA (INHBA基因敲除质粒)是一种在动物细胞中可以同时表达Cas9、目的基因的sgRNA和puromycin抗性基因的质粒。用于在动物细胞中直接基于CRISPR/Cas9技术敲除目的基因,或者通过包装慢病毒后基于CRISPR/Cas9技术敲除目的基因。本质粒中sgRNA的有效性已经通过T7EI法的验证。

本质粒在细菌中为Amp抗性,全长约13,000bp。本质粒的关键图谱信息请参考图1。本质粒可直接转染细胞用于目的基因的CRISPR/Cas9敲除,以及通过puromycin筛选稳定细胞株;也可以与pMDLg、Rev及VSV-g共转HEK293T细胞进行重组慢病毒(lentivirus)的包装,然后再用于感染细胞或组织并进行目的基因的CRISPR/Cas9敲除。

图1. 表达sgRNA、Cas9和puromycin抗性的pLenti-sgRNA质粒关键图谱信息。

本质粒中的sgRNA基于碧云天研发的CRISPR/Cas9 sgRNA快速筛选和验证体系获得,sgRNA的有效性已经通过T7EI法验证。

本质粒用于实验时,建议同时选购无任何靶向的对照质粒pLenti-Control-sgRNA (L00011)或靶向GFP的对照质粒pLenti-GFP-sgRNA (L00013)

碧云天同时提供基于CRISPR/Cas9技术的INHBA基因敲除的质粒(L00296 pLenti-INHBA-sgRNA)慢病毒(L00297 INHBA Knockout Lentivirus)HEK293T细胞(L00298 INHBA Knockout HEK293T Cells)HEK293T敲除细胞的RIPA裂解液(L00299 INHBA Knockout HEK293T RIPA Lysate)HEK293T敲除细胞的Trizol裂解液(L00300 INHBA Knockout HEK293T Trizol Lysate)等产品,具体请在碧云天网站查询或在本产品网页点击相应产品。

INHBA基因的基本信息如下:

Species Gene Symbol Gene ID GenBank Accession Transcript
Human INHBA 3624 BC007858 NM_002192

 

About the gene
Official Symbol INHBA
Previous Symbol -
Official Full Name inhibin subunit beta A
Synonyms -
Location 7p14.1
Gene Type protein-coding gene
Uniprot ID P08476
Pathway/Library cAMP & Ca Signaling Pathway Related Genes Library; Cell Proliferation Related Genes Library
Gene Summary The inhibin beta A subunit joins the alpha subunit to form a pituitary FSH secretion inhibitor. Inhibin has been shown to regulate gonadal stromal cell proliferation negatively and to have tumor-suppressor activity. In addition, serum levels of inhibin have been shown to reflect the size of granulosa-cell tumors and can therefore be used as a marker for primary as well as recurrent disease. Because expression in gonadal and various extragonadal tissues may vary severalfold in a tissue-specific fashion, it is proposed that inhibin may be both a growth/differentiation factor and a hormone. Furthermore, the beta A subunit forms a homodimer, activin A, and also joins with a beta B subunit to form a heterodimer, activin AB, both of which stimulate FSH secretion. Finally, it has been shown that the beta A subunit mRNA is identical to the erythroid differentiation factor subunit mRNA and that only one gene for this mRNA exists in the human genome.
包装清单:
产品编号 产品名称 包装
L00296 pLenti-INHBA-sgRNA 5µg
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存,至少两年有效。

注意事项:

碧云天拥有sgRNA序列的知识产权,如果需要sgRNA序列,请在订购后发送邮件向info@beyotime.com索取。sgRNA与质粒及其序列信息,未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。使用者在发表研究论文或结果时,应注明来源。

慢病毒包装使用的包装质粒,可以订购碧云天的Lentivirus Packaging Vectors Set A (L00002),包括pMDLg、Rev和VSV-g。

对于非目录产品的CRISPR基因敲除用的sgRNA表达质粒的定制,可联系碧云天技术服务service@beyotime.com

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1. 质粒的扩增和鉴定:
a. 扩增:请先取少量本质粒转化Stbl3感受态细胞或其它适当的感受态细胞,Amp抗性,进行质粒的小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。
b. 鉴定:抽提获得的质粒可使用菌落PCR的方法进行鉴定,Forward primer为5′TATACGATACAAGGCTGTTAGAGAG3′,Reverse primer为5′ACTGTGGGCGATGTGCGCTCTG3′,PCR产物约为700bp。也可进一步测序鉴定,测序引物为hU6,Forward primer为5′ATGGACTATCATATGCTTACCGTA3′。比对序列为:ATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNN
GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCAC
CGAGTCGGTGCTTTTTTG。其中N为sgRNA序列。
2. 慢病毒包装与浓缩:
a. 细胞的准备:复苏用于慢病毒包装的HEK293T细胞,24小时后1:3传至10cm培养皿,37℃、5% CO2培养箱24小时。复苏后的细胞尽量能培养一周以上后再进行慢病毒的包装,效果更好。
b. 慢病毒的包装:对于10cm培养皿,在500µl不含抗生素和血清的DMEM培养液(高糖DMEM或低糖DMEM均可)或Opti-MEM® Medium中加入本sgRNA质粒、pMDLg、Rev、VSV-g分别为10µg、6.5µg、2.5µg、3.5µg,混匀后加入一定量转染试剂和培养液混合液,转染试剂推荐使用Lipo293™转染试剂(C0521)Lipo6000™转染试剂(C0526)Lipo8000™转染试剂(C0533)或其它合适的转染试剂,具体转染步骤参考特定转染试剂的产品说明书。转染后24小时和48小时可两次收集培养液上清,上清用0.45µm的针头滤器进行过滤,该上清含慢病毒,可直接使用。上清可分装后-80℃冻存。
c. 慢病毒的浓缩:如果需要滴度更高的慢病毒,可以使用100kDa的超滤管进行超滤浓缩,如碧云天的超滤管(15ml, 100kDa MWCO, PES, Sartorius分装) (FUF158)或Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Unit (UFC9100),4℃、按照推荐的最高转速离心30分钟左右,最终剩下约400µl的病毒浓缩液。病毒浓缩液可以分装后-80℃冻存。
3. 慢病毒的感染:
a. 确定puromycin的筛选浓度:待感染的细胞按一定密度铺在12孔或24孔中,按照0、0.2、0.5、1、1.5、2、3、4、5µg/ml这样的浓度测试细胞对puromycin的敏感性,推荐使用碧云天的Puromycin Dihydrochloride (嘌呤霉素) (ST551)。两天后细胞全部死亡的最低浓度即为该细胞的puromycin筛选浓度,具体步骤参考碧云天该产品的使用说明:https://www.beyotime.com/product/ST551-10mg.htm
b. 慢病毒感染细胞:按实验需要将细胞铺板(如12孔板),细胞数以第2天密度约50%为宜。设置非感染细胞组、对照组和基因敲除组。37℃培养过夜后,培养液中加入5~10μg/ml的Polybrene(C0351/ST551)。病毒感染前,从-80℃冰箱取出病毒后冰浴融化,参考相关文献或者根据预实验得到的MOI值加入适量病毒,对于未浓缩的病毒,可以直接按0.5ml/孔加入细胞,对于浓缩或测定滴度的病毒,一般100µl/孔或107 TU已经足够,轻轻摇匀,37℃继续培养。两天后,吸除含病毒的培养液,换为新鲜的含一定浓度的puromycin的培养液进行筛选,一般筛选2天后,非感染细胞组细胞逐渐死去,加入病毒组存活率比较高,就可以收集部分细胞检测目的蛋白的表达或进行其它实验。培养过程中,可以将细胞转至6孔板或10cm培养皿进行扩大培养。一周之后,puromycin浓度可减半。如果有必要后续可以通过将细胞稀释至2.5个/ml,然后按照每孔200µl接种到96孔板中(每孔平均0.5个细胞),筛选单克隆细胞株。病毒感染的方法可参考Polybrene (C0351)的使用说明:https://www.beyotime.com/product/C0351-1ml.htm
4. 直接转染细胞与稳定株的筛选
a. 选择合适的拟敲除目的基因的细胞,使用Lipo8000™转染试剂(C0533)Lipo6000™转染试剂(C0526)或其它合适的转染试剂,具体转染细胞的步骤参考特定转染试剂的产品说明。
b. 确定puromycin的筛选浓度:细胞按一定密度铺在12孔或24孔中,按照0、0.2、0.5、1、1.5、2、3、4、5µg/ml这样的浓度测试细胞对puromycin的敏感性,推荐使用碧云天的Puromycin Dihydrochloride (嘌呤霉素) (ST551)。两天后细胞全部死亡的最低浓度即为该细胞的puromycin筛选浓度,具体步骤参考碧云天该产品的使用说明:https://www.beyotime.com/product/ST551-10mg.htm
c. 转染后约48小时,按照上述检测获得的puromycin筛选浓度加入puromycin,筛选阳性细胞。一般筛选2天后,阴性细胞逐渐死去。培养过程中,可以将细胞转至6孔板或10cm培养皿进行扩大培养。一周之后,puromycin浓度可减半。如果有必要后续可以通过将细胞稀释至2.5个/ml,然后按照每孔200µl接种到96孔板中(每孔平均0.5个细胞),筛选单克隆细胞株。
5. 基因编辑的鉴定:
a. 对于多克隆细胞,可以通过T7 Endonuclease I (T7EI)进行鉴定,即提取细胞的基因组DNA,在sgRNA序列两边设计引物进行PCR扩增,然后进行T7EI酶切,具体请参考碧云天的T7 Endonuclease I (CRISPR等基因突变鉴定用) (D7080)基因组编辑突变检测试剂盒(D0508);也可以通过相应的抗体进行检测。
b. 对于单克隆细胞,可通过PCR扩增出sgRNA靶向的基因片段后进行常规测序的方式进行验证,同时也可以使用相应的抗体进行检测。
相关产品:
产品编号 产品名称 包装
L00002-5µg CRISPR/Cas9 Packaging Vectors Set A 5µg/each
L00002-100µg CRISPR/Cas9 Packaging Vectors Set A 100µg/each
L00011-5µg pLenti-Control-sgRNA 5µg
L00011-100µg pLenti-Control-sgRNA 100µg
L00013-5µg pLenti-GFP-sgRNA 5µg
L00013-100µg pLenti-GFP-sgRNA 100µg
C0222 青霉素-链霉素溶液(100X) 100ml
C0351-1ml Polybrene (Hexadimethrine Bromide) 1ml
C0351-50mg Polybrene (Hexadimethrine Bromide) 50mg
C0521 Lipo293™转染试剂 0.5/1.5/7.5ml
C0526 Lipo6000™转染试剂 0.5/1.5/7.5ml
C0533 Lipo8000™转染试剂 0.5/1.5/7.5ml
D0378 Stbl3甘油菌 200μl
ST551-10mg Puromycin Dihydrochloride (嘌呤霉素) 10mg/ml×1ml
ST551-50mg Puromycin Dihydrochloride (嘌呤霉素) 10mg/ml×5ml
ST551-250mg Puromycin Dihydrochloride (嘌呤霉素) 250mg
ST1380-500mg Polybrene (≥94%, Reagent grade) 500mg
ST1380-2g Polybrene (≥94%, Reagent grade) 2g
ST1380-10g Polybrene (≥94%, Reagent grade) 10g
FF345-10pcs 针头滤器(0.45µm/28mm, PES, Sterile, Sartorius分装) 10个/袋
FF345T-10pcs 针头滤器(0.45µm/28mm, PES, Sterile, 进口分装) 10个/袋
FF345-50pcs 针头滤器(0.45µm/28mm, PES, Sterile, Sartorius原装) 50个/盒
FF365-10pcs BeyoGold™针头滤器(0.45µm/33mm, PES, Sterile) 10个/袋
FF365-100pcs BeyoGold™针头滤器(0.45µm/33mm, PES, Sterile) 100个/盒
FF375-10pcs BeyoGold™针头滤器(0.45µm/13mm, PES, Sterile) 10个/袋
FF375-100pcs BeyoGold™针头滤器(0.45µm/13mm, PES, Sterile) 100个/盒
FUF158-2pcs 超滤管(15ml, 100kDa MWCO, PES, Sartorius分装) 2个/袋
FUF158-12pcs 超滤管(15ml, 100kDa MWCO, PES, Sartorius分装) 12个/袋
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