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核酸相关> DNA标记和检测> EMSA相关
EMSA探针生物素标记试剂盒
产品编号: GS008
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价格:¥1516.00元
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GS008 EMSA探针生物素标记试剂盒 20次 1516.00元

EMSA探针生物素标记试剂盒(EMSA Probe Biotin Labeling Kit)是一种通过Terminal Deoxynucleotidyl Transferase(TdT)把生物素标记的dUTP添加到单链DNA 3'末端,然后通过退火产生生物素标记的EMSA探针的试剂盒。通常DNA的3'末端被标记后不会干扰基于序列特异性蛋白结合的EMSA检测。
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase(TdT)可以在不依赖于模板的情况下催化在DNA的3'-OH端加上dNTP的反应。关于TdT催化双链DNA末端加dNTP的反应效率,3'端突出的双链DNA要比平端或3'端缩进的双链DNA高很多。TdT催化单链DNA末端加dNTP的反应效率要比双链DNA高很多。在适当的条件下,TdT也可以催化RNA 3'末端加NTP的反应。
本试剂盒适合标记纯化的单链DNA,如果用于标记EMSA探针,可以在单链标记后再进行退火。
本试剂盒中提供了已经用生物素标记好的Biotin-Control Oligo,可以用作检测DNA标记效率的对照。
如果每个标记反应的探针量为5pmol,本试剂盒可以用于20个标记反应。
包装清单:

产品编号 产品名称 包装
GS008-1 TdT Buffer(5X) 250μl
GS008-2 TdT(10U/μl) 20μl
GS008-3 Biotin-11-dUTP(5μM) 100μl
GS008-4 Biotin-Control Oligo(0.4μM) 100μl
GS008-5 Ultrapure water 1ml
GS008-6 探针标记终止液 200μl
GS008-7 TE 15ml
GS008-8 退火缓冲液(10X) 150μl
说明书 1份

保存条件:
-20℃保存。
注意事项:
需自备用于检测探针标记效率的带正电荷尼龙膜,以及用于生物素检测的相关试剂。带正电荷尼龙膜(FFN10/FFN11/FFN13/FFN15)可以向碧云天订购。相应的用于生物素检测的化学发光法EMSA试剂盒(GS009)也可以向碧云天订购。
      本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。 

使用说明:
1.准备工作:
A.取出TdT Buffer (5X)、Biotin-11-dUTP和Ultrapure water溶解,并置于冰浴上备用。
B.取出待标记的单链EMSA探针,用水稀释至1μM,并置于冰浴上备用。如果待标记的EMSA探针为双链,95℃加热2分钟,然后立即放置到冰水浴中,使双链的EMSA探针转变为单链的探针,然后同样用水稀释至总的单链DNA浓度为1μM,即每条单链的浓度为0.5μM,相当于最初双链的EMSA探针浓度为0.5μM。
2.DNA探针的标记:

Ultrapure water 29μl
TdT Buffer(5X) 10μl
待标记探针(1μM) 5μl
Biotin-11-dUTP(5μM) 5μl
TdT(10U/μl) 1μl
总体积 50μl

A.参考上表设置反应体系。注:对于双链的EMSA探针的标记反应,建议一次做两管,即总体积共100μl,以最终获得足够的生物素标记EMSA探针用于后续EMSA检测。
B.用枪轻轻吹打混匀,切勿vortex。37℃孵育30分钟。
C.加入2.5μl 探针标记终止液,轻轻混匀终止反应。
3.TdT的去除:
A.探针标记反应终止后,加入52.5μl氯仿-异戊醇(24:1),vortex使有机相和水相充分混合以抽提TdT。(说明:静止后有机相和水相会很快分层)。
B.12000-14000g离心1-2分钟。吸取上清备用。上清即为被生物素标记的单链DNA探针。
4.探针的纯化(选做):
通常为实验简便起见,可以不必纯化标记好的探针。有些时候,纯化后的探针会改善后续实验的结果。
如需纯化,可以按照如下步骤操作:
A.对于100μl标记好的探针,加入1/4体积即25μl的5M醋酸铵,再加入2体积即200μl的无水乙醇,混匀。
B.-70℃至-80℃沉淀1小时,或-20℃沉淀过夜。
C.4℃,12,000g-16,000g离心30分钟。小心去除上清,切不可触及沉淀。
D.4℃,12,000g-16,000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀,但不宜过分干燥。
E.加入50μlTE,完全溶解沉淀。标记好的探针可以-20℃保存。
5.生物素标记探针标记效率的检测:
A.取5μlBiotin-Control Oligo(0.4μM),加入196μlTE,混匀,稀释成10nM Biotin-Control Oligo(作为标准品)。取出适量10nM Biotin-Control Oligo,依次 稀释成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和 0.25nM。
B.取3μl步骤3B所获得的生物素标记的DNA探针(100nM),加入27μlTE,混匀,稀释成10nM生物素标记的探针(作为待测样品)。取出适量的10nM 生物素标记的探针,依次稀释成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。
C.参考下面的表格,取一适当大小的带正电荷尼龙膜,在膜上做好相应标记。 对于经过梯度稀释的标准品和待测样品,分别取2μl滴加到膜上。在膜上滴加标准品或待测样品时,请注意使液滴充分被膜吸收,在膜上形成一个湿的圆形小斑点。说明:如果条件许可,可以使用专门 用于点杂交或狭缝杂交的设备进行探针标记效率的检测,探针的用量参考下表,浓度可以再稀释50倍,而所用体积可以相应放大50倍至100μl。

探针浓度 10nM 5nM 2.5nM 1nM 0.5nM 0.25nM
Biotin-Control Oligo 2μl 2μl 2μl 2μl 2μl 2μl
生物素标记的探针 2μl 2μl 2μl 2μl 2μl 2μl
探针量 20fmol 10fmol 5fmol 2fmol 1fmol 0.5fmol

D.滴加完所有的标准品和样品后,将膜室温晾干。
E.用紫外交联仪(UV-light cross-linker)选择254nm紫外波长,120mJ/cm2,交联30-45秒。如果没有紫外交联仪可以使用普通的手提式紫外灯(例如碧云天的手提紫外检测仪(EUV002)),距离膜5-10厘米左右照射1-5分钟。也可以使用超净工作台内的紫外灯,距离膜5-10厘米左右照射1-10分钟。最佳的交联时间可以使用标准品自行摸索
F.随后可以立即采用各种生物素检测试剂盒,检测出样品的生物素标记效率;也可以室温存放数天直至进行后续检测。
G.如果最后采用的是ECL类试剂或其它类似试剂进行检测,则可以对比样品和标准品的灰度,从而计算出探针的标记效率。例如2fmol量的待测样品探针的灰度和1fmol标准品的灰度相同,则说明探针的标记效率大致为50%,待测样品中总探针的浓度约为1μM,而实际被生物素标记的探针约为0.5μM。探针的标记效率也可以通过建立标准曲线进行比较精确的计算。用于后续检测时通常要求标记效率不低于30%。有文献报道标记效率和3'末端的碱基无关,但和整个待标记探针的序列有关。由于在TdT的催化下可以在待标记探针的3'端加上多个Biotin标记的dUTP,因此有时会出现标记效率大于100%的情况。
6.生物素标记EMSA探针的制备:
A.对于步骤3B标记好的单链DNA探针,把正义链和反义链等体积混合(不可根据标记效率调整摩尔比例)。对于最初使用变性的双链EMSA探针进行探针标记的情况,直接进入下一步。
B.加入退火缓冲液(10X),使退火缓冲液的最终浓度为1X,混匀。例如待退火探针的体积为100微升,则加入11微升退火缓冲液(10X)。
C.如下设置PCR仪进行退火反应:

步骤 温度 时间 说明
1 95℃ 2分钟 让oligo充分变性
2 每8秒下降0.1℃,降至25℃(注1) 约90分钟 退火
3 4℃ 长时间保持 暂时存放

注意:如果所用的PCR仪不具备下降0.1℃的功能,也可以设置为每90秒下降1℃。
D.退火反应结束后,-20℃保存标记好的EMSA探针。此时的EMSA探针已经可以直接用于后续的EMSA检测,也可以对探针进行适当纯化后再进行EMSA检测。

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使用本产品的文献:
1. Zhang J, Xu YJ, Xiong WN, Zhang ZX, Du CL, Qiao LF, Ni W, Chen SX.
《中德临床肿瘤学杂志》 . 2008;7(4):217-22.
2. Wang X, Li C, Chen Y, Hao Y, Zhou W, Chen C, Yu Z.
BIOCHEM BIOPH RES CO . 2008 Jun 27;371(2):283-8. (IF 2.985)
3. Zhang J, Xu YJ, Xiong WN, Zhang ZX, DU CL, Qiao LF, Ni W, Chen SX.
《癌症》 . 2008 Jun;28(3):251-6.
4. Zhang J, Xu Y, Xiong W, Zhang Z, Du C, Qiao L, Ni W, Chen S.
J HUAZHONG U SCI-MED . 2008 Jun;28(3):251-6. (IF 1.151)
5. Wei Y, Weng D, Li F, Zou X, Young DO, Ji J, Shen P.
Apoptosis . 2008 Aug;13(8):1031-42. (IF 4.543)
7. Peng X, Wang Y, Kolli S, Deng J, Li L, Wang Z, Raj JU, Gou D.
AM J PHYSIOL-CELL PH . 2012 Aug 1;303(3):C267-77. (IF 3.485)
8. Li K, Dan Z, Hu X, Ouzhu M, Ciren Y, Wang Z, Wang J, Yang X, Ze Y.
Mol Cell Biochem . 2013 Apr;376(1-2):137-43. (IF 2.795)
9. Sun J, Fan L, Li M, Zhang Y, Cheng L.
《中德临床肿瘤学杂志》 . 2013 April;12(4):181-7.
10. Wang LP, Wang Y, Zhao LM, Li GR, Deng XL.
Biochem Pharmacol . 2013 May 15;85(10):1486-94. (IF 4.96)
11. Fang L, Xu Z, Wang GS, Ji FY, Mei CX, Liu J, Wu GM.
PLoS One . 2014 Jul 15;9(7):e101406. (IF 2.74)
12. Xiaolong Liu, Zhifeng Zhang, Xiaoyu Ma, Xueyu Li, Di Zhou, Beibei Gao, Yajiao Bai.
Aquatic Toxicology . 2016 Jan; 170:229–39. (IF 3.794)
13. Liu X, Zhang Z, Ma X, Li X, Zhou D, Gao B, Bai Y.
Aquat Toxicol . 2016 Jan;170:229-39. (IF 4.344)
14. Wu XB, Liu Y, Wang GH, Xu X, Cai Y, Wang HY, Li YQ, Meng HF, Dai F, Jin JD.
SCI REP-UK . 2016 Feb 19;6:21420. (IF 3.998)
15. Liu X, Qin Z, Li X, Ma X, Gao B, Zhang Z.
Aquat Toxicol .2016 Jun;175:232-40. (IF 4.344)
17. Huang TL, Mu N, Gu JT, Shu Z, Zhang K, Zhao JK, Zhang C, Hao Q, Li WN, Zhang WQ, Liu NN, Zhang Y, Zhang W, Xue XC, Zhang YQ.
J Bone Miner Res . 2017 Feb;32(2):407-418. (IF 5.854)
18. Zhang L, Wang H, Fan Y, Gao Y, Li X, Hu Z, Ding K, Wang Y, Wang X.
SCI REP-UK . 2017 Apr 21;7:46763. (IF 3.998)
19. You M, Jin J, Liu Q, Xu Q, Shi J, Hou Y.
J Cell Biochem . 2017 Jun;118(6):1556-1562. (IF 4.237)
20. Zhang W, Xu Y, Xu Q, Shi H, Shi J, Hou Y.
Carcinogenesis . 2017 Jul 1;38(7):748-755. (IF 4.603)
21. Jiang M, Yin M, Wu S, Han X, Ji K, Wen M, Lu T.
SCI REP-UK . 2017 Jul 6;7(1):4803. (IF 3.998)
22. Xu H, Shi X, Wang Z, Gao C, Wang C, Wang Y.
Plant Sci . 2017 Aug;261:38-49. (IF 3.591)
23. Wang J, Ge P, Qiang L, Tian F, Zhao D, Chai Q, Zhu M, Zhou R, Meng G, Iwakura Y, Gao GF, Liu CH.
Nat Commun . 2017 Aug 15;8(1):244. (IF 12.121)
24. Fu J, Liu Q, Wang C, Liang J, Liu L, Wang Q.
J Exp Bot . 2017 Dec 21. (IF 5.908)
25. Wang Z,Tian X,Zhao Q,Liu Z,Li X,Ren Y,Tang J,Fang J,Xu Q,Bu Q
Plant Cell . 2018 Jan;30(1):228-244. (IF 9.618)
26. Zhang L,Wang H,Zhou Y,Zhu Y,Fei M
Neurochem Int . 2018 Sep;118:304-313. (IF 3.881)
27. Liu Q,Li X,Yan S,Yu T,Yang J,Dong J,Zhang S,Zhao J,Yang T,Mao X,Zhu X,Liu B
BMC Plant Biol . 2018 Oct 26;18(1):257. (IF 3.497)
29. Bello BK,Hou Y,Zhao J,Jiao G,Wu Y,Li Z,Wang Y,Tong X,Wang W,Yuan W,Wei X,Zhang J
Plant Biotechnol J . 2018 Dec 15. (IF 8.154)
30. Meihong Sun,Min Shi,Yao Wang,Qiang Huang,Tingpan Yuan,Qiang Wang,Can Wang,Wei Zhou,Guoyin Kai
J Exp Bot. 2019 Jan 1;70(1):243-254.;doi: 10.1093/jxb/ery349.
31. Da-Gang Hu,Jian-Qiang Yu,Peng-Liang Han,Xing-Bin Xie,Cui-Hui Sun,Quan-Yan Zhang,Jia-Hui Wang,Yu-Jin Hao
New Phytol. 2019 Mar;221(4):1966-1982.;doi: 10.1111/nph.15511.
32. Fan W,Gao X,Ding C,Lv Y,Shen T,Ma G,Yan L,Song S
Biochem Biophys Res Commun. 2019 Apr 2;511(2):468-475.
33. Deng C,Hao X,Shi M,Fu R,Wang Y,Zhang Y,Zhou W,Feng Y,Makunga NP,Kai G
Plant Sci. 2019 Jul;284:1-8. (IF 3.591)
34. Zhu KC,Liu BS,Guo HY,Zhang N,Guo L,Jiang SG,Zhang DC
Int J Biol Macromol. 2019 Nov 19;pii: S0141-8130(19)36697-8. (IF 5.162)
35. Ye W,Liu T,Zhu M,Zhang W,Huang Z,Li S,Li H,Kong Y,Chen Y
Front Bioeng Biotechnol. 2019 Nov 26;7:334.
37. Zhu KC,Liu BS,Zhang N,Guo HY,Guo L,Jiang SG,Zhang DC
Fish Shellfish Immunol. 2020 Jan;96:107-113.
39. Xie H,Gu Y,Wang W,Wang X,Ye X,Xin C,Lu M,Reddy BA,Shu P
Sci Rep. 2020 Jan 21;10(1):766.
40. Kong XM,Zhou Q,Zhou X,Wei BD,Ji SJ
J Exp Bot. 2020 Jan 23;71(3):1078-1091. (IF 5.908)
41. Yao J,Shen Z,Zhang Y,Wu X,Wang J,Sa G,Zhang Y,Zhang H,Deng C,Liu J,Hou S,Zhang Y,Zhang Y,Zhao N,Deng S,Lin S,Zhao R,Chen S
J Exp Bot. 2020 Feb 19;71(4):1527-1539. (IF 5.908)
43. Zhang L,Fei M,Wang H,Zhu Y
Brain Res Bull. 2020 Apr;157:26-36. (IF 3.37)
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