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核酸相关> 菌种与质粒> 病毒构建
pShuttle-CMV-C-EGFP(腺病毒质粒,绿色荧光)
产品编号: D8117-1μg
产品包装:1μg
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价格: ¥ 888.00
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产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
D8117-1μg pShuttle-CMV-C-EGFP(腺病毒质粒,绿色荧光) 1μg 888.00元
D8117-100μg pShuttle-CMV-C-EGFP(腺病毒质粒,绿色荧光) 100μg 1169.00元

pShuttle-CMV-C-EGFP (腺病毒质粒, 绿色荧光)是碧云天自行研发的用于构建表达C端EGFP(绿色荧光蛋白)融合蛋白的重组腺病毒包装用的穿梭质粒。本穿梭质粒构建后,需要和预转染了pAdEasy-1质粒的BJ5183菌株(D8107)以及重组腺病毒包装细胞配合使用才能完成重组腺病毒的包装。

pShuttle-CMV-C-EGFP质粒可以用于在包装成腺病毒后表达C端含EGFP(Enhanced GreenFluorescent Protein, 增强绿色荧光蛋白)标签的融合蛋白。该质粒含有CMV启动子,可以高效启动目的蛋白在细胞中的表达。在多克隆位点的后面有一个EGFP的完整编码序列,因此在多克隆位点根据阅读框插入目的基因就可以表达C端含有EGFP标签的融合蛋白。利用EGFP的荧光特性可以比较容易地观察融合蛋白的表达水平和细胞内定位,也可以利用GFP抗体来检测或免疫沉淀融合蛋白。

本质粒为卡那霉素抗性。

重组腺病毒(Recombinant adenoviruses)是一种常见的用于在培养细胞或动物体内表达外源基因的重要工具。重组腺病毒具有感染宿主细胞范围广、感染不依赖细胞分裂、高滴度及目的基因表达水平高等特性。最常用的腺病毒载体是人类血清5型腺病毒。改造后的人类血清5型腺病毒,删除了在病毒装配过程中起关键作用的E1基因和非必须的能表达逃避宿主免疫的E3基因,E1和E3基因的删除使得重组腺病毒不能自我复制,同时给外源基因的插入提供了空间,最长可插入7.5kb的外源基因。从而提高了重组腺病毒的的安全性和可操作性。再利用携带E1基因的AD-293、293A、HEK293等细胞作为包装细胞就可以完成重组腺病毒的包装。

pShuttle系列的穿梭质粒携带外源目的基因,经过Pme I线性化,随后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1(D8106)共转化到大肠杆菌BJ5183中,或者转化到已经预转化了pAdEasy-1质粒的BJ5183菌株(D8107)同源重组。BJ5183菌株表达recET基因,具有很高的基因同源重组(homologous recombination)活性,使带有目的基因的穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1通过末端反向重复序列同源重组,实现外源基因与腺病毒基因组的整合。将重组的携带外源基因的腺病毒质粒用Pac I线性化后转染到AD-293、293A、HEK293等重组腺病毒包装细胞中进行包装。从而制备获得高滴度、自我复制缺陷并且带有目的基因的重组腺病毒。

目的基因引入时不能含有Pme I及Pac I这两个酶切位点,如果含有该两个酶切位点的目的基因,需要对该位点进行突变方可进行基因操作。

pShuttle-CMV-C-EGFP主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
left inverted terminal repeat 1–103
encapsidation signal (ES) 183–331
CMV promoter 341–933
multiple cloning site 940–988
EGFP 993-1712
SV40 polyA 1732–1943
Ad5 right arm homology 1948–4202
Ad5 left arm homology 4250–5133
right inverted terminal repeat 4234–5236
pBR322 origin 5444–6111
kanamycin resistance ORF 6920–7711

pShuttle-CMV-C-EGFP 质粒(8197bp)的图谱如下:

pShuttle-CMV-C-EGFP质粒的详细图谱见说明书:https://www.beyotime.com/Manual/D8117 pShuttle-CMV-C-EGFP.pdf

pShuttle-CMV-C-EGFP 中没有的酶切位点(Restriction enzymes that do not cut pShuttle-CMV-C-EGFP)包括:

Acc65 I Afl II Age I Asc I Asp718
Blp I BsiC I BsiW I BstB I Bsu36 I
Cla I Eco72 I EcoN I Esp I Fse I
Kpn I Nru I Pml I Pvu I Sfi I

pShuttle-CMV-C-EGFP 中的单酶切位点(Restriction enzymes that cut pShuttle-CMV-C-EGFP once)包括:

SnaB I TAC|GTA 679 PflM I CCAN,NNN`NTGG 2620
Nhe I G`CTAG,C 940 BstX I CCAN,NNNN`NTGG 3059
Not I GC`GGCC,GC 945 Bbs I GAAGAC 8/12 3861
BamH I G`GATC,C 952 Bbv II GAAGAC 7/11 3862
Hind III A`AGCT,T 958 Bst1107 I GTA|TAC 4215
EcoR V GAT|ATC 966 Xca I GTA|TAC 4215
Sal I G`TCGA,C 970 Pme I GTTT|AAAC 4236
Mlu I A`CGCG,T 976 EcoR I G`AATT,C 4241
Bgl II A`GATC,T 982 Avr II C`CTAG,G 4783
PaeR7 I C`TCGA,G 988 BspH I T`CATG,A 6179
Xho I C`TCGA,G 988 Psp1406 I AA`CG,TT 6578
Xba I T`CTAG,A 1714 Rsr II CG`GWC,CG 7584
Spe I A`CTAG,T 1720 Dra III CAC,NNN`GTG 7931
Sca I AGT|ACT 1725 Xmn I GAANN|NNTTC 8185
Hpa I GTT|AAC 1842

pShuttle-CMV-C-EGFP 质粒中推荐使用的测序引物序列如下:

forward primer (888-907): 5´GGTCTATATAAGCAGAGCTG3´

Reverse primer (1734-1756): 5´GTGGTATGGCTGATTATGATCAG 3´

pShuttle-CMV-C-EGFP 的全序列信息:pShuttle-CMV-C-EGFP序列.txt

腺病毒包装的具体方法和步骤可以参考如下网页:

https://www.beyotime.com/support/pShuttle.htm

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D8117-1µg pShuttle-CMV-C-EGFP 1μg
D8117-100µg pShuttle-CMV-C-EGFP 100μg
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1µg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.1µg/µl,共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。
3.pShuttle-CMV-C-EGFP质粒在其多克隆位点适当酶切后可以插入待表达的目的基因,插入目的基因时注意与EGFP不能发生移码突变。携带目的基因的质粒经过Pme I线性化,随后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1(D8106)共转化到大肠杆菌BJ5183中,或者转化到已经已经预转了pAdEasy-1质粒的BJ5183菌株(D8107)中进行同源重组。将重组的携带外源基因的腺病毒质粒用Pac I线性化后转染到AD-293、293A、HEK293等重组腺病毒包装细胞中进行包装。从而制备得高滴度、自我复制缺陷并且带有目的基因的重组腺病毒。
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