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核酸相关> DNA操作> 内切酶与外切酶
T7 Endonuclease I (CRISPR等基因突变鉴定用)
产品编号: D7080S
产品包装:250U
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价格: ¥ 278.00
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产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
D7080S T7 Endonuclease I (CRISPR等基因突变鉴定用) 250U 278.00元
D7080M T7 Endonuclease I (CRISPR等基因突变鉴定用) 1250U 1035.00元
D7080L T7 Endonuclease I (CRISPR等基因突变鉴定用) 5000U 3311.00元

碧云天生产的T7 Endonuclease I (T7 Endo I, T7EI),即T7核酸内切酶I,是一种比较特殊的DNA内切酶,能识别并切割不完全配对的DNA(non-perfectly matched DNA)、十字型结构DNA(cruciform DNA structures)、Holliday结构或交叉DNA(Holliday structures or junctions)和异源双链DNA(heteroduplex DNA)。T7EI切割的位点位于错配碱基5’端的第一、第二或第三个磷酸二脂键。此外,T7EI也能以很慢的速度切割含有缺刻的双链DNA(nicked double-stranded DNA)。本产品常用于CRISPR/Cas9等导致的基因突变的鉴定。

T7EI切割错配碱基位点的活性如图1所示。需要特别注意的是T7EI能识别长度大于或等于2bp的插入、缺失或突变导致的错配DNA,不能识1bp的插入、缺失或突变。


图1.T7 Endonuclease I (T7EI)切割位点示意图。X,代表错配位点。

用途:T7EI常用于CRISPR/Cas9、TALEN或以及其它基因编辑工具形成的突变体检测,也常用于基因点突变和SNP的检测,也可以用于分解四方向交叉DNA(four-way junction)或分支DNA(branched DNA)、检测或切割异源双链DNA和缺刻DNA(heteroduplex and nicked DNA),以及随机切割线性DNA(借助线性DNA分子内或分子间部分配对形成的不完全匹配双链DNA)用于进行鸟枪法(Shot-gun)克隆和测序等。

碧云天生产的T7EI酶切野生型/突变体形成的杂合双链DNA的效果(图2):

图2.碧云天生产的T7EI和国际知名品牌的同类产品(Competitor T7EI)酶切野生型/突变体形成的杂合双链DNA效果图。使用高保真酶分别PCR扩增不带突变位点的野生型DNA片段(WT,800bp)以及有5个碱基突变的DNA片段(Mutant,800bp),经电泳检测它们的PCR产物均为单一条带后,按图所示将200ng的野生型片段、200ng的突变体片段及100 ng突变体片段与100 ng野生型混合物分别经变性、退火和复性处理(95℃ 5min, 95℃-85℃ -2℃/second, 85℃-25℃ -0.1℃/second)后加入10U T7EI,37℃酶切30min,然后进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测。如图所示,野生型与突变体的混合物经退火后部分片段会形成5个碱基的错配loop区并被T7EI识别和酶切,800bp的片段被切割成600bp和200bp两个片段,而单独的野生型或单独的突变体则不会被切割。

碧云天生产的T7EI酶兼容性好,与碧云天的多种PCR扩增体系是完全兼容的(图3)。对于PCR产物通常无须任何纯化处理即可用于本产品的酶切鉴定。

图3.碧云天生产的T7 Endonuclease I (T7EI)对于碧云天不同PCR buffer的兼容效果。酶切体系为20µl ,将本试剂盒提供的Control Template (D7080-3)分别加入不同的PCR buffer体系至PCR buffer为1X,混匀后,取5µl至一新的离心管中作为酶切底物。随后加入2µl 10X Reaction Buffer (D7080-2)、12µl 超纯水和1µl T7EI (10U/µl) (D7080-1),混匀后37℃酶切30min,1%的琼脂糖凝胶电泳检测。1. 不加T7EI;2. 加T7EI,用水取代PCR buffer;3. D7205-2 10X PCR Buffer (with Mg2+);4. D7218-2 10X BeyoTaq Buffer (with Mg2+);5. D7216-2 10X Pfu Buffer (with Mg2+);6. D7220-2/D7222-2 10X BeyoFusion™ Buffer (with Mg2+);7. D7211-2 10X Hot-Start PCR Buffer;8. D7213-2 10X BeyoAmp™ Buffer;9. D7215-2 10X BeyoAmp™ Plus Buffer;10. D7241S-2 10X HemoTaq™ PCR Buffer;11. D7243S-2 10X HemoTaq™ HF PCR Buffer;12. D7248S-2 10X PlantTaq™ PCR Buffer。如图所示,本产品和这些PCR buffer体系都可以很好兼容。因此在目的条带正确且单一时可以不经过纯化直接取5µl PCR产物至酶切体系中变性退火后进行酶切反应。

来源:大肠杆菌表达的T7噬菌体基因3的重组蛋白。

活性定义:One unit is defined as the amount of enzyme required to convert > 90% of 1 μg of supercoiled cruciform pUC(AT) to > 90% linear form in a total reaction volume of 50 μl in 1 hour at 37℃。

10X Reaction Buffer:500 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT, pH 7.9。

纯度:纯度大于95%,不含T7EI之外的DNA内切酶和外切酶,不含RNA酶,不含磷酸酯酶。

失活或抑制:85℃加热15min或加入EDTA至终浓度20mM可以使T7EI失活。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D7080S-1 T7 Endonuclease I (10U/µl) 25µl
D7080S-2 10X Reaction Buffer 0.2ml
D7080S-3 Control template (100ng/µl) 10µl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
D7080M-1 T7 Endonuclease I (10U/µl) 125µl
D7080M-2 10X Reaction Buffer 0.5ml
D7080M-3 Control template (100ng/µl) 20µl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
D7080L-1 T7 Endonuclease I (10U/µl) 0.5ml
D7080L-2 10X Reaction Buffer 1.2ml
D7080L-3 Control template (100ng/µl) 50µl
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存,至少一年有效。

注意事项:

T7EI是一种依赖于底物结构并进行选择性酶切的酶,其对不同的DNA底物显示出不同的反应活性。因此,切割特定底物时,必须控制好酶量和反应时间。

反应温度超过42℃时,会增加其非特异性酶切的活性;而反应温度超过55℃则会降低其酶活性。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.按下表配置反应体系(以20μl 体系为例)。通常PCR产物推荐使用5μl,过多的PCR产物由于PCR buffer的存在可能会干扰后续的酶切反应。
Component Positive Control Negative Control Control template
PCR product(约200ng) 5 μl 5 μl 2 μl
10 x T7 Endonuclease I Reaction Buffer 2 μl 2 μl 2 μl
Nuclease-free Water 12 μl 12 μl 15 μl
2.退火反应:
Step Temperature Time
1 95℃ 5min
2 95℃–85℃ –2℃/sec
3 85℃–25℃ –0.1℃/sec
4 4℃ Hold
3.在上述19μl退火后的体系中加入1 μl T7EI,37℃孵育15-30min。通常孵育15min已经足够,如果希望确保获得更好的酶切效果可以孵育30min。
4.85℃加热15min或加入1.5 μl的0.25 M EDTA终止酶切反应。
5.将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳,拍照观察,并分析酶切效果。Control Template酶切后的效果请参考图3。
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