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Klenow Fragment, Exo-
产品编号: D7039
产品包装: 100U
产品价格: 152.00元
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产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
D7039 Klenow Fragment, Exo- 100U 152.00元

      Klenow Fragment,Exo-,即没有外切酶活性的Klenow片段,是大肠杆菌聚合酶I(E.coli.DNA polymerase I)的大片段
(Large Fragment)缺失了外切酶活性的突变体。Klenow Fragment,Exo-保留了DNA聚合酶I的5'→3'聚合酶活性,但缺少完整
的Klenow酶的5'→3'和3'→5'外切酶活性。
      特点:由于Klenow Fragment,Exo-没有外切酶活性,其在末端补平时经常会在3'末端额外加上1个或多个核苷酸,因此不能用于产生平末端而用于后续的连接。
      用途:5'突出末端的标记;随机引物法进行DNA标记;Sanger双脱氧法进行DNA测序等。 
      来源:由大肠杆菌表达,表达基因的来源为突变的 polA 基因片段。
      分子量:约68kDa(单体)。
      活性定义:37℃30分钟内,催化10nmol脱氧核糖核苷酸(dNTPs)摻入到多聚核苷酸中所需的酶量定义为1个活性单位。
      酶活性检测条件:67mM potassium phosphate(pH7.4),6.7mM MgCl2,1mM 2-mercaptoethanol,0.033mM
dATP,0.033mM dTTP,0.4MBq/ml[3H]-dTTP,62.5μg/ml poly(dA-dT)·poly(dA-dT)。
      纯度:不含DNA内切酶,不含RNase。
      酶储存溶液:25mM Tris-HCl(pH7.5),0.1mM EDTA,1mM DTT,50%(v/v)glycerol。
      Reaction Buffer(10X):500mM Tris-HCl(pH8.0 at 25℃),50mM MgCl2, 10mM DTT。
      缓冲液兼容性:在碧云天的内切酶反应缓冲液1X O、1X R、1X Y、2X Y中的活性为100%,在1X B、1X G中的活性为100%;在碧云天的Taq、Pfu DNA polymerase和M-MuLV反应缓冲液中的活性为100%。
      失活或抑制:75℃加热10分钟或加入适量EDTA均可导致Klenow Fragment,Exo-失活。金属离子螯合剂,无机焦磷酸盐(PPi),大剂量的无机磷酸盐(Pi)均对Klenow Fragment,Exo-有抑制作用。
包装清单:

产品编号 产品名称 包装
D7039-1 Klenow Fragment, Exo-(5U/μl) 100U
D7039-2 Reaction Buffer(10X) 0.3ml
说明书 1份

保存条件:
      -20℃保存。
注意事项: 
      酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上,使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。
      本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
      为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。 

使用说明:
1. 随机引物法进行DNA标记:
a. 参考如下表格设置反应体系:

DNA 10μl(100ng)
Reaction Buffer(10X) 5μl
125μM random decamer or hexamer primer 10μl
补充无核酸酶的去离子水 至40μl
混匀后沸水浴孵育5-10分钟,立即置于冰浴冷却。进行后续步骤前离心沉淀液体。
3 dNTP Mixture(0.25mM each , without the labeled dNTP) 4μl
[α-32P]-dNTP, ~110 TBq/mmol(3000Ci/mmol) 1.85MBq(50μCi)
Klenow Fragment,Exo- 1μl(5U)
补充无核酸酶的去离子水 至50μl

b. 按上表设置好反应体系后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
c. 对于random decamer primer,37℃孵育5分钟;对于random hexamer primer,37℃孵育10分钟。
d. 加入4μl 0.25mM dNTP,混匀后37℃孵育5分钟。
e. 加入1μl 0.5M EDTA,pH8.0终止反应。
f. 取1μl上述液体用于检测标记的效率。
g. 用Sephadex G-50或Bio-Gel P-60或其它适当试剂盒纯化标记好的探针。
2. 双链DNA 5'突出(5'overhang)末端的标记:
a. 参考如下表格设置反应体系:

Digested DNA 10~15μl(0.1~4μg)
Reaction Buffer(10X) 2μl
[α-32P]-dNTP, ~15-30 TBq/mmol(400-800Ci/mmol)
0.74 MBq(20μCi)
或[α-32P]-dNTP, ~110 TBq/mmol(3000Ci/mmol)
2.96 MBq(80μCi)
3 dNTP Mixture(2.5mM each, without the labeled dNTP) 2μl
Klenow Fragment, Exo- 0.2μl(1U)
补充无核酸酶的去离子水 至20μl

b. 按上述体系配好之后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
c. 30℃孵育15分钟。
d. 75℃孵育10分钟终止反应。
3. 其他用途可以参考上述用途或适当的文献资料进行。

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