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核酸相关> 菌种与质粒> 荧光探针质粒
pCMV-jGCaMP7c (高对比度钙离子荧光探针)
产品编号: D2863-100µg
产品包装:100µg
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价格:¥1129.00元
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D2863-1µg pCMV-jGCaMP7c (高对比度钙离子荧光探针) 1µg 888.00元
D2863-100µg pCMV-jGCaMP7c (高对比度钙离子荧光探针) 100µg 1129.00元

pCMV-jGCaMP7系列质粒(jGCaMP7b/jGCaMP7c/jGCaMP7f/jGCaMP7s)是用于钙离子(Ca2+)荧光检测的哺乳动物细胞表达质粒,表达的是经过突变和优化并适用于细胞或组织中钙离子荧光检测的M13-GFP-CaM融合蛋白。M13-GFP-CaM融合蛋白这个钙离子探针(calcium probe)中,环状排列的绿色荧光蛋白(circularly permuted green fluorescent protein, cpGFP)一端和钙调蛋白(calmodulin, CaM)融合表达,另一端与可以和钙调蛋白CaM相互作用的肌球蛋白轻链激酶M13 (也称RS20)肽链融合表达。这样当钙离子结合钙调蛋白时,可以改变钙调蛋白的构象,同时也会影响和钙调蛋白相互作用的M13的构象,钙调蛋白和M13的构象改变最终导致GFP的构象改变,从而影响其荧光的强弱,最终实现对于钙离子浓度变化的检测。

图1. GCaMP7系列蛋白结构图。其中pRSET A Tag中含有6X His tag。

碧云天构建的pCMV-jGCaMP7系列质粒(jGCaMP7b/jGCaMP7c/jGCaMP7f/jGCaMP7s)是最新一代基因编码的钙离子探针系列,适用于常见细胞的细胞内钙离子水平变化检测,并且特别适合用于监测特定条件下神经元中的钙离子水平的变化。

jGCaMP7系列的四个融合蛋白与GCaMP6系列相比,各有其突出特点:高亮度钙离子荧光探针jGCaMP7b (brighter baseline fluorescence)有更亮的本底荧光,并且灵敏度可达到GCaMP6s的3倍,未结合钙离子时的荧光强度比GCaMP6s增强50%;高对比度钙离子荧光探针jGCaMP7c (high contrast with low baseline fluorescence)有高对比度低和更低的背景荧光,并且灵敏度是GCaMP6s的2.7倍,对比度显著增强;快速响应型钙离子荧光探针jGCaMP7f (fast kinetics)具有快速动力学特点,反应速率是GCaMP6f的5倍和GCaMP6s的3倍,更加适合检测钙离子的动态变化;高灵敏度钙离子荧光探针jGCaMP7s (sensitive and slow) 具有高灵敏度但响应速度相对较慢的特点,灵敏度可达GCaMP6s的5倍以上,并且响应速率也比GCaMP6s快。

pCMV-jGCaMP7系列质粒是在针对其M13-GFP-CaM融合蛋白中肽链相互作用的界面区域进行突变筛选并优化而得到的。四个融合蛋白对应的突变氨基酸序列参考表1。

表1:jGCaMP7突变位点

  M13 Linker1 cpGFP Linker2 CaM
jGCaMP7s A52V A317L
jGCaMP7f H78K A317L R381T T383S G392R
jGCaMP7b H78K L302P A317L M374Y
jGCaMP7c L59Q E60P H78K M378G K379S T383S T412N

jGCamP7c中的突变主要发生在Linker1(L59Q/E60P)、cpGFP(H78K)和CaM(M378G/K379S/T383S/T412N)上。pCMV-jGCaMP7c质粒含有CMV启动子,可以高效启动目的蛋白在细胞中的表达,该质粒为卡那霉素抗性。

pCMV- jGCaMP7c质粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
CMV promoter 1-602
T3 promoter and T3 primer binding site 620-639
jGCaMP7b 693-2045
T7 promoter and T7 primer binding site 2107-2128
SV40 polyA signal 2140-2523
f1 origin of ss-DNA replication 2661-2965
bla promoter 2990-3114
SV40 promoter 3134-3427
Neomycin/kanamycin resistance ORF 3507-4298
HSV-thymidine kinase (TK) polyA signal 4299-4757
pUC origin 4886-5553

pCMV- jGCaMP7c质粒(5605bp)的图谱如下:

pCMV-jGCaMP7c质粒的详细图谱见说明书:https://www.beyotime.com/Manual/D2863 pCMV-jGCamP7c.pdf

pCMV-jGCaMP7c中没有的酶切位点(Restriction enzymes that do not cut pCMV-jGCaMP7b)包括:

AclI AfeI AflII AgeI AhdI AscI AsiSI
BaeI BbsI BbvCI BglII BsiWI BsmBI BspEI
BssHII BstEII BstZ17I EcoNI EcoRI EcoRV Esp3I
FseI HindIII NruI PaeR7I PflMI PmeI PpuMI
PshAI PspXI SbfI ScaI SgrAI SwaI XcmI
AclI AfeI AflII AgeI AhdI AscI AsiSI

pCMV-jGCaMP7c中的单酶切位点(Restriction enzymes that cut pCMV-jGCaMP7b once)包括:

AccI GT`MK,AC 799 PciI A`CATG,T 5553
ApaI G,GGCC`C 2062 PflFI GACN`N,NGTC 3735
ApaLI G`TGCA,C 5239 PluTI G,GCGC`C 3638
AvaI C`YCGR,G 680 PmlI CAC|GTG 1919
BamHI G`GATC,C 687 PspOMI G`GGCC,C 2058
BcgI NN` (N)10CGA(N)6TGC(N)10,NN 735 PstI C,TGCA`G 1744
BlpI GC`TNAGC 858 PvuI CG,AT`CG 2140
BmgBI CAC|GTC 810 RsrII CG`GWC,CG 4151
Bpu10I CC`TNA,GC 1029 SacII CC,GC`GG 662
BsaI GGTCTCN`NNNN, 4624 SalI G`TCGA,C 798
BsaXI ,NNN` (N)9AC(N)5CTCC(N)7,NNN` 2687 SapI GCTCTTCN`NNN, 1609
BsoBI C`YCGR,G 680 SfiI GGCCN,NNN`NGGCC 3410
BspQI GCTCTTCN`NNN, 1609 SfoI GGC|GCC 3636
CspCI ,NN` (N)11CAA(N)5GTGG(N)10,NN` 382 SmaI CCC|GGG 682
DraIII CAC,NNN`GTG 2753 SnaBI TAC|GTA 342
KasI G`GCGC,C 3634 SpeI A`CTAG,T 2052
MfeI C`AATT,G 2837 SrfI GCCC|GGGC 682
MluI A`CGCG,T 2523 StuI AGG|CCT 3456
MscI TGG|CCA 3717 TspMI C`CCGG,G 680
NarI GG`CG,CC 3635 Tth111I GACN`N,NGTC 3753
NdeI CA`TA,TG 240 XbaI T`CTAG,A 2046
NotI GC`GGCC,GC 668 XmaI C`CCGG,G 680

pCMV-jGCaMP7c的全序列信息:D2863pCMV-jGCamP7c序列.txt

pCMV-jGCaMP7c质粒转染Hela细胞12h后,于培养基中加入Ionomycin (2μM)后150秒内的荧光变化效果请参考图2本产品网站上的视频。

图2.pCMV-jGCaMP7c质粒转染Hela细胞12h后2μM Ionomycin处理前后的荧光变化效果图。pCMV-jGCaMP7c质粒转染培养在六孔板中的Hela细胞12h后,先用PBS洗涤细胞2-3次,加入1ml DMEM,选择适当视野,在荧光显微镜下拍摄视频。开始拍摄5-10秒后,加入1ml含有4μM Ionomycin的新鲜DMEM培养液(最终浓度为2μM Ionomycin),继续拍摄视频约2-3分钟。图中可见加入Ionomycin之前很细胞的荧光比较弱,加入Ionomycin后细胞的荧光逐渐变强,时间较长后荧光又会逐渐变弱。A. 未加Ionomycin;B. 加入Ionomycin 30s;C:加入Ionomycin 60s;D:加入Ionomycin 120s。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D2863-1µg pCMV-jGCaMP7c(高亮度钙离子荧光探针) 1µg
D2863-100µg pCMV-jGCaMP7c(高亮度钙离子荧光探针) 100µg
说明书 1份
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-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1µg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2.100μg包装的本产品质粒浓度为0.1μg/μl,共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。
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