使用说明：
1.类器官完全培养液的配制。
a.将类器官基础培养液、类器官培养液添加剂A、B和C从-20ºC取出，置于冰上或4ºC进行解冻。
b.按照类器官基础培养液:添加剂A:添加剂B:添加剂C=100:2:1:1的比例配制类器官完全培养液。例如配制100ml类器官完全培养液，取2ml添加剂A、1ml添加剂B和1ml添加剂C加入100ml类器官基础培养液中，混匀即得约100ml类器官完全培养液。
注：配制好的类器官完全培养液可适当分装后，置于4ºC保存，四周内有效；也可适当分装后置于-20ºC保存，六个月有效，解冻后，不可重新冻融。
2.小鼠肠道隐窝分离。
a.洗涤液I的配制：按照1:100的比例混合青霉素-链霉素溶液(100X) (C0222)与D-PBS (C0221D)，配制适量洗涤液I。例如，取1ml青霉素-链霉素溶液(100X)加入至99ml D-PBS中，混匀即得100ml洗涤液I。
b.洗涤液II的配制：取适量BSA (ST025)溶于D-PBS使其终浓度为0.1% (w/v)。例如，称取0.1g BSA溶于100ml D-PBS中，混匀即得100ml洗涤液II。
c.选择8-12周小鼠，提前禁食12小时，按照相应规范处死小鼠，将小鼠浸入75%酒精中杀菌5分钟，吸水纸去除多余酒精。
d.在超净台中提前准备好无菌手术器械(FS500)，将杀菌后的小鼠移入超净台，固定在泡沫板上。
e.剪开腹部皮肤，暴露出腹部肌肉。沿腹中线剪开腹部肌肉至肋骨，将肌肉翻向两边固定，充分暴露出腹腔。取出消化道组织，采集小肠组织，剪断胃和十二指肠连接处和回肠末端，去除靠近胃的1cm (即十二指肠)和近盲肠的前1cm，最后获取总长度约20cm的小肠组织。
f.将小肠组织置于10cm培养皿(FCD100)，加入15ml洗涤液I，用带针头的10ml注射器(FS810)吸满洗涤液I，从十二指肠开口处插入肠管，将肠腔内容物冲洗干净。再将小肠组织转移至新的10cm培养皿中，加入15ml洗涤液I，去除多余的脂肪和肠系膜，沿着小肠纵向剪开肠腔，镊子夹住小肠在皿中充分涮洗，可重复1-2次直到肉眼见不到食物残渣等杂质。
g.准备新的10cm培养皿，加入4ml洗涤液I，将洗涤干净的小肠平铺在皿中，绒毛面朝上，使用载玻片(FSL004)边缘或软质细胞刮(FSCP023/FSCP029)沿黏膜层轻柔刮去绒毛，然后用洗涤液I冲洗干净。
h.准备50ml离心管(FTUB550/FTUB650)，加入15ml洗涤液II，用镊子夹住小肠一端悬于离心管上方，从小肠底端开始将小肠剪成小于2mm的小肠片段落入离心管中。
i.取一支移液管，先用BeyoOrganoid™抗黏附润洗液(C5525)润湿，然后反复吹打小肠片段3-10次，然后静置30秒使小肠片段沉淀，弃上清，仅留适量液体覆盖住小肠片段。再加入15ml洗涤液II按照相同方式进行洗涤，重复洗涤10-20次，直至上清液基本澄清为止。
j.向离心管中加入30ml BeyoOrganoid™类器官传代温和消化液(C5513)，颠倒混匀。拧紧离心管，将离心管水平埋入碎冰中，置于摇床上100rpm孵育30-60分钟，推荐使用碧云天BeyoShaker™数字式圆周摇床(E6676)。
k.轻轻颠倒离心管10次，静置30秒后弃上清，仅留适量液体覆盖住小肠片段。
l.向离心管中加入15ml洗涤液II。取一支润湿后的移液管，反复吹打小肠片段10次，然后静置30秒使小肠片段沉淀，吸取上清并使用70μm孔径的细胞过滤器(FSTR070/FSTR072)过滤并用50ml离心管收集，标记为“馏分1”。再次加入15ml BeyoOrganoid™类器官传代温和消化液，反复吹打小肠片段10次，然后静置30秒使小肠片段沉淀，吸取上清并使用70μm孔径的细胞过滤器过滤并用50ml离心管收集，标记为“馏分2”；重复6次，收集馏分1-6。
m.分别取0.5ml馏分1-6至6孔板各孔中，显微镜下观察，选取隐窝较多，杂质较少的两个馏分，各取10ml加入15ml离心管(FTUB515/FTUB615)中。300×g，4ºC离心5分钟，弃上清，保留沉淀。
n.用10ml预冷的洗涤液II洗涤每一管的沉淀，200×g，4ºC离心5分钟。弃上清，保留沉淀。
o.用10ml预冷的DMEM/F-12培养液(C2736)重悬沉淀，并使用细胞计数板(FSL020-FSL022)计数。例如10μl含15个隐窝，则1ml中隐窝数量为1500个，计数结果为1500 crypts/ml。
3.类器官的原代培养。
a.根据隐窝计数结果计算：例如隐窝悬液计数结果为1500 crypts/ml，如果需要接种48孔板10个孔，每孔200μl，按照1.5 crypts/μl接种：则需要隐窝悬液体积为10孔×200μl/孔×1.5 crypts/μl÷1500 crypts/ml=2ml。
b.取2ml隐窝悬液于15ml离心管中，200×g，4ºC离心5分钟。小心吸掉上清保留沉淀，加入1ml隐窝类器官完全培养液和1ml基质胶混匀。推荐使用碧云天Matrix-Gel™基质胶(类器官用, 不含酚红) (C0396)和BeyoGold™系列超低吸附培养孔板(FULA035-FULA985)。
c.从37ºC培养箱取出提前预热的48孔板，将混匀的含隐窝和细胞因子的基质胶按照200μl/孔轻轻滴加到每孔的中央，注意动作轻柔，以免基质胶液滴散开或形成气泡。
d.接种完毕后将48孔板放入培养箱20-30分钟使基质胶凝固。
e.沿孔壁向孔中加入500μl类器官完全培养液，置于培养箱中培养。
f.每日观察，按需拍照。每2-3天更换新鲜的类器官完全培养液。
g.大约7天时即可见完全结构的类器官，即可传代、冻存、固定包埋切片或者收取隐窝做其它分析。
4.类器官的传代和扩增。
注：当隐窝类器官完全成熟的时，可以进行传代。如培养7天左右时，隐窝类器官平均直径超过300-500μm或者类器官出芽明显。可参考步骤4a-4c进行操作将类器官细胞从基质胶中释放出来，但更推荐使用BeyoOrganoid™类器官分离回收液(C5519)，可在不破坏类器官三维结构和生理功能的前提下，温和而快速地从基质胶中分离出类器官。 a.将培养板置于冰上，小心去除类器官完全培养液上清。
注：避开类器官基质胶悬滴，吸取时注意不要将悬滴吸起。
b.每孔加入500μl预冷的D-PBS，使用BeyoOrganoid™抗黏附润洗液润湿过的1ml吸头将类器官/基质胶/D-PBS混合物上下移液吹吸，以完全破坏基质胶结构。在这一步骤中，充分机械破坏基质胶结构，将类器官细胞从基质胶中释放出来非常关键。
c.使用BeyoOrganoid™抗黏附润洗液润湿过的1ml注射器(FS801)将混合物从针头吸入，再通过针头打出，重复2-3次，通过机械力将类器官充分切割分散。
d.将类器官基质胶悬浮液转移至15ml离心管中，加入3ml PBS (含0.1% BSA)，混匀后，150×g，4ºC离心10分钟，去除上清；再加入3ml类器官完全培养液，混匀后，200×g，4ºC离心10分钟，去除上清，即得类器官沉淀。
e.按照1:3比例向类器官沉淀中加入类器官完全培养液，轻轻混匀。例如原始体积为200μl，则传代后需加入600μl类器官完全培养液。
f.再加入与类器官完全培养液等体积的基质胶，轻轻混匀。
g.从37ºC培养箱取出提前预热的48孔板，将混匀的含隐窝和细胞因子的基质胶按照200μl/孔轻轻滴到每孔的中央，注意动作轻柔，以免基质胶液滴散开或形成气泡。
h.接种完毕后将48孔板放入培养箱20-30分钟使基质胶凝固。
i.沿孔壁向孔中加入200μl类器官完全培养液，置于培养箱中培养。
j.每日观察，按需拍照。每2-3天更换新鲜的类器官完全培养液。
5.类器官的冻存。
注：类器官完全成熟时可进行冻存。
a.将培养板置于冰上，小心去除类器官完全培养液上清。
b.每孔加入500μl预冷的BeyoOrganoid™无血清类器官细胞冻存液(C5515)，使用BeyoOrganoid™抗黏附润洗液润湿过的1ml吸头将类器官/基质胶/冻存液混合物上下移液吹吸，以完全破坏基质胶结构。
c.使用BeyoOrganoid™抗黏附润洗液润湿过的1ml吸头将类器官重悬液按每管0.5-1ml分装至细胞冻存管(FCV011/FCV016/FCV021/FCV028)中。推荐LAB MARKER (耐酒精记号笔, 0.4/1.0mm) (FPP21/FPP23/FPP25)进行标记，特别适合细胞复苏时使用70%-75%乙醇对冻存管表面进行消毒。
d.将冻存管转移至细胞冻存盒中进行程序降温后转移至液氮罐中长期保存。类器官冻存时，程序降温速度以1ºC/分钟为宜，推荐使用具有降温速度为1ºC/分钟的BeyoCool™细胞冻存盒(FCFC012/FCFC015/FCFC021)系列产品进行程序性降温冻存，并在-80ºC放置至少24小时后转移至液氮中保存。
6.类器官的复苏。
a.将冻存管在37ºC水浴锅中迅速完全融化(保持冻存管的盖子在液面以上以防止污染)，并适当轻轻摇晃促融，切勿vortex。快速、完全融化可以提高细胞的复苏效果。
b.打开冻存管前时用70%酒精擦拭细胞冻存管外壁，注意某些记号笔不耐酒精，小心标注的记号被擦拭掉。推荐LAB MARKER (耐酒精记号笔, 0.4/1.0mm) (FPP21/FPP23/FPP25)进行标记，特别适合细胞复苏时使用70%-75%乙醇对冻存管表面进行消毒。
c.使用BeyoOrganoid™抗黏附润洗液润湿过的1ml吸头轻缓吹吸冻存细胞溶液2-3次。
d.将完全融化的细胞溶液转移至含有3ml PBS (含0.1% BSA)的15ml无菌离心管中。150×g，4ºC离心10分钟，吸除上清，注意不要吸走类器官细胞沉淀。
e.将细胞沉淀使用基质胶重悬，参照步骤4进行类器官培养，或根据后续实验需求，加入适量预热的类器官完全培养液重悬细胞，轻轻吹匀后转移至培养器皿中，放入细胞培养箱中培养。
参考文献：
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6.Hoarau-Véchot J, Rafii A, Touboul C, Pasquier J. Int J Mol Sci. 2018. 19(1):181.
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