使用说明：
1.梯度的制备。
本实验基于密度梯度离心，即依靠不同细胞或颗粒在不同密度的溶液里沉降速度不同进行分离，所以目标工作液的密度必须非常精确。但确保最终分离溶液密度的同时，必须维持好一定的渗透压，以保护分离的对象。所以应先将BeyoColl™密度梯度分离液与高浓度的等渗溶液，如10X PBS (ST448/ST476)、1.5M NaCl溶液(ST1840)或2.5M蔗糖溶液(ST1670/ST1672)，混合，然后再用蒸馏水补足至最终体积，并精确达到目标密度。对于NaCl溶液和蔗糖溶液，配制完毕后的终浓度应分别为0.15M和0.25M。细胞可在平衡盐溶液、细胞培养液或NaCl溶液配制的梯度中分离；而亚细胞组分或病毒在盐离子条件下容易聚集，因此建议使用蔗糖溶液配制的梯度分离。
注：用户可直接按照步骤1a计算出的体积值，取相应体积的各溶液直接混合为相应密度的分离液，然后按照步骤1c制备梯度。也可以按照步骤1b，预先配制好等渗溶液(Stock isotonic Beyocoll, SIB, 约340mOsm/kg H2O)，再根据所需的密度对等渗溶液进行稀释，然后按照步骤1c制备梯度。
a.一步法配制工作液(直接配制目标工作液)。
(a)根据所需密度，可按以下公式计算出配制目标工作液所需的BeyoColl™密度梯度分离液、稀释液和蒸馏水体积。
V0=V×(ρ-0.1ρ10-0.9)/(ρ0-1)
其中V0为BeyoColl™密度梯度分离液体积(ml)，V为目标工作液总体积(ml)，ρ为目标工作液密度(g/ml)，ρ0为BeyoColl™密度梯度分离液密度(1.130g/ml)，ρ10为稀释液密度(1.5M NaCl溶液的密度为1.058g/ml；2.5M蔗糖溶液的密度为1.316g/ml)。
(b)根据公式计算出V0后，量取V/10的稀释液(1.5M NaCl溶液或2.5M蔗糖溶液)，将BeyoColl™密度梯度分离液和稀释液混合，并需要使用蒸馏水补足至V。例如，制备100ml密度为1.07g/ml的目标工作液，稀释液为1.5M NaCl溶液时：ρ=1.07g/ml，ρ0=1.130g/ml，ρ10=1.058g/ml，V=100ml，代入公式：V0=100×(1.07-0.1×1.058-0.9)/(1.130-1)=49.4ml。因此，可取49.4ml BeyoColl™密度梯度分离液和10ml 1.5M NaCl溶液混合，并用蒸馏水补足至100ml。
b.两步法配制工作液(先配制等渗溶液，再稀释)。
(a)等渗溶液的配制。对于细胞样品，将BeyoColl™密度梯度分离液与1.5M NaCl溶液、10X PBS按照体积比9:1的比例进行配制。对于亚细胞颗粒或病毒样品，将BeyoColl™密度梯度分离液与2.5M蔗糖溶液按照体积比9:1的比例进行配制。
(b)将等渗溶液稀释到需要的一系列密度。可按以下公式计算出配制目标工作液所需的等渗溶液和稀释液的体积。对于细胞样品，可采用0.15M NaCl溶液、1X细胞培养液或1X PBS稀释等渗溶液至所需密度。对于亚细胞颗粒或病毒样品，可采用0.25M蔗糖溶液稀释等渗溶液至所需密度。
ρSIB=(9×ρ0+1×ρ1)/10
VSIB=V×(ρ–ρ2)/(ρSIB–ρ2)
V2=V-VSIB
其中ρSIB为等渗溶液密度(g/ml)，ρ0为BeyoColl™密度梯度分离液密度(1.130g/ml)，ρ为目标工作液密度(g/ml)，ρ1为等渗溶液稀释液密度(1.5M NaCl溶液的密度为1.058g/ml；2.5M蔗糖溶液的密度为1.316g/ml)，ρ2为目标工作液稀释液密度(0.15M NaCl溶液和0.25M蔗糖溶液的密度为1.00g/ml)，VSIB为等渗溶液体积(ml)，V为目标工作液体积(ml)，V2为目标工作液稀释液体积(ml)。
(c)确定目标工作液体积和目标工作液密度后，根据公式计算出VSIB和V2后，量取等渗溶液和稀释液，混合后即为目标工作液。例如，制备100ml密度为1.07g/ml的目标工作液，稀释液为0.15M NaCl溶液时：ρ0=1.130g/ml，ρ1=1.058g/ml，代入公式：ρSIB=(9×1.130+1×1.058)/10=1.123g/ml；V=100ml，ρ=1.07g/ml，ρ2=1.00g/ml，ρSIB=1.123g/ml，代入公式：VSIB=100×(1.07–1)/(1.123–1)=56.91ml；V=100ml，VSIB=56.91ml，代入公式：V2=100–56.91=43.09ml。因此，可取56.91ml等渗溶液和43.09ml 0.15M NaCl溶液混合，即为目标工作液。
c.制备密度梯度。按照高密度向低密度逐层放置的先后顺序，用吸头或注射器，紧贴管壁，自然缓慢流下液体，确保上层溶液(高密度)不会溅入下层(低密度)或者混入分界处，形成梯度。
注：可先将管壁用FBS湿润，然后除去多余血清，这种预处理可使逐层叠加的分离液平稳沿管壁流下，使形成满意的界面。
2.密度梯度离心。
在密度梯度离心过程中，可根据实验目标选择不同的离心方式。
a.角转头高速离心(形成自发梯度)。当使用角转头并以较高转速离心时(NaCl体系：10,000×g；蔗糖体系：25,000×g)，BeyoColl™密度梯度分离液可在离心力作用下自发形成从管底至管顶的连续密度梯度。在此方法中，样品可在离心前直接与BeyoColl™密度梯度分离液均匀混合。离心开始后，样品颗粒将在自发形成的梯度中按其密度大小进行分布，并最终在与其自身密度相等的位置聚集，形成清晰的等密度区带。本方法适用于亚细胞颗粒或病毒样品的高效分离。
b.水平转头低速离心(依赖预制梯度)。对于完整的活细胞等对剪切力敏感的样品，推荐使用水平转头进行低速离心(如400×g)。该方法通常依赖于预先制备的连续或不连续密度梯度。离心时需设置较慢的升、降速程序(如离心20–30分钟)，本方法能有效维持梯度结构的稳定性，并避免已分离的细胞区带因流体扰动而重新混合，从而确保细胞能够温和地迁移至其等密度位置，并获得更高的细胞活性和回收率。
3.取出样品。
离心后会形成一个连续密度梯度(约1.0-1.3g/ml)，每种颗粒或细胞都会漂浮或沉降到其自身密度(即浮力密度或漂浮密度，Buoyant density)相等的等密度区带，随后小心吸取目标区带，即可获得目标组分。BeyoColl™密度梯度分离液分离的典型细胞与亚细胞组分的密度与分布位置请参考下表(仅供参考，不同物种可能有一些区别)。

Sample Types		Buoyant Density (g/ml)	Position after Centrifugation	Notes
Cells	血小板(Platelet)	<1.04	上层或漂浮液体表面	最轻，常漂浮于液面
	淋巴细胞(Lymphocyte)	1.055–1.065	中层(界面)	常在透明带处聚集
	单核细胞(Monocyte)	1.060–1.068	中下层	位于淋巴细胞之下
	嗜中性粒细胞(Neutrophil)	1.080–1.090	下层	紧贴红细胞上方
	红细胞(Erythrocyte)	>1.09	底部沉淀层	密度最高，完全沉底
Subcellular components	细胞质(Cytoplasm)	<1.05	上层或漂浮	最轻的可溶性组分
	微粒体(Microsome)	1.09–1.12	中层	分布较广
	溶酶体(Lysosome)	1.12–1.15	中下层	常位于线粒体之上
	线粒体(Mitochondria)	1.17–1.20	下层	主要集中于较高密度区
	细胞核(Nucleus)	>1.20	最底部	核密度最高

4.清洗。BeyoColl™密度梯度分离液由于没有细胞毒性，且不会粘附在细胞膜上，通常可不必去除，细胞可直接进行培养，病毒可直接进行感染，细胞器可直接用于功能性研究。如有必要，也可以根据以下方法来进行清洗以去除。
a.细胞样品。用预冷、5倍体积的PBS (C0221A)或生理盐水(ST341)轻柔洗涤，4ºC、200-500×g离心8-10分钟，弃上清，如有必要可以再重复洗涤2-3次，收集细胞沉淀。
b.亚细胞组分(如线粒体、溶酶体等细胞器)。用预冷、5倍体积的PBS (C0221A)或者生理盐水(ST341)轻柔洗涤后，4ºC、10,000-20,000×g离心10-30分钟。小心弃上清，收集沉淀。
注：具体的离心力取决于目标亚细胞组分。
c.对于病毒、外泌体或更小的颗粒。未稀释的样品，4ºC、100,000×g离心120分钟(水平转子)或90分钟(角转子)以沉淀BeyoCollTM密度梯度分离液中的介质，收集上清。
d.凝胶过滤、离子交换色谱法、超滤管离心和透析等方法进行洗涤。
5.示例。以肝脏组织免疫细胞的分离为例，具体可参考BeyoImmun™小鼠多组织免疫细胞分离试剂盒(C4503)或其它免疫细胞分离试剂盒相关内容。
图2.碧云天BeyoColl™密度梯度分离液(C4546)基于密度梯度离心分离肝脏组织免疫细胞的示意图。离心管中的液体由上至下分四层：脂肪组织密度较低，悬浮于表面，为第一层；第二层为40%密度梯度分离液；富集淋巴细胞和髓系细胞的免疫细胞介于40%密度梯度分离液和70%密度梯度分离液之间，通常为环状乳白色，为第三层；第四层为70%密度梯度分离液；红细胞与细胞碎片密度较大，沉于底部，为第五层。实际效果会因实验仪器、实验条件等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。
a.密度梯度分离液的配制。
100%密度梯度分离液：将BeyoColl™密度梯度分离原液与10X PBS按体积比9:1混合；
70%密度梯度分离液：将100%密度梯度分离液与DMEM培养液(不含FBS)按体积比7:3混合；
40%密度梯度分离液：将100%密度梯度分离液与PBS (含5% FBS)按体积比4:6混合。
b.按照实验要求制备肝脏组织单细胞悬液，推荐使用碧云天BeyoImmun™小鼠多组织免疫细胞分离试剂盒(C4503)。用1ml 40%密度梯度分离液重悬细胞沉淀。
注：在15ml离心管中添加不同梯度的密度梯度分离液时，动作须轻柔缓慢，且液体分层后不要晃动。
c.使用水平转子离心机22ºC，600×g离心30分钟，设置离心机升速为2，降速为1。
d.离心结束后，将其缓慢取出并放置在试管架上，切勿摇晃。离心后的分离效果示意图请参考图2。
e.吸弃上层脂肪组织，然后用巴氏吸管(FPIP004)穿过40%密度梯度分离液层，小心、缓慢地吸取中间的乳白色环状层(目的细胞)，并转移至新的15ml离心管中。
f.将PBS (含5% FBS)加满至15ml，上下颠倒混匀，使用冷冻离心机4ºC，500×g离心8分钟，弃上清，所得沉淀即为目的细胞，用PBS (含5% FBS)重悬细胞至所需体积，用于后续实验。
参考文献：
1.Pertoft H. J Biochem Biophys Methods. 2000. 44(1-2):1-30.
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产品编号	产品名称	包装
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C0251/C0252	胎牛血清(产地南美)	50ml/500ml
C2701	DMEM, High Glucose	500ml/500ml×6
C3702	红细胞裂解液	120ml/500ml
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C4505	BeyoImmun™小鼠脾脏单细胞悬液制备试剂盒	10次/50次
C4546	BeyoColl™密度梯度分离液	25ml/100ml
ST341-500ml	生理盐水(0.9% NaCl, 无菌)	500ml
ST447	PBS (1X, premixed powder)	1L/5×1L
ST448-1L	PBS (10X, premixed powder)	1L
ST476	PBS (10X)	500ml