碧云天生产的Universal AAV Titration Kit by qPCR，也称qPCR法通用型AAV滴度检测试剂盒，是一种基于qPCR (Quantitative PCR)方法用于高效、精确和快速测定不同血清型腺相关病毒(Adeno-associated Virus, AAV)滴度的试剂盒。本产品含有优化比例的高品质UDG酶和dUTP，可有效消除PCR扩增过程中带来的产物污染问题造成的假阳性或CT值偏低。

腺相关病毒(Adeno-associated Virus, AAV)是Dependovirus属Parvovirus家族的微小单链DNA病毒，包含100多种血清型。AAV毒感染细胞后通常不会与基因组DNA重组，但可以长期稳定地表达目的基因，特别是可以在很多不分裂的细胞中长期稳定表达。AAV还具有滴度高，体内注射不产生明显的免疫反应，对于增殖和非增殖细胞感染效率高等优点，因此在生物医学领域有非常广泛的应用[1]。

UDG (Uracil-DNA Glycosylase)，也称UNG (Uracil-N-glycosylase)，可催化含尿嘧啶的DNA链中的尿嘧啶(dU)碱基和脱氧核糖之间的N-糖苷键发生水解，从而释放游离尿嘧啶，主要应用于消除PCR扩增过程中带来的产物污染问题。其防止污染的原理为：在PCR反应中加入适量的dUTP，以dUTP替代dTTP掺入DNA中，形成含dU碱基的PCR扩增产物；后续进行PCR反应时，使用UDG酶选择性切割可能被污染而带入的之前PCR扩增产生的含有dU的单链或双链DNA，从而避免之前的PCR扩增产物可能的污染对于本次PCR扩增带来的负面影响。

本试剂盒适用范围广。本试剂盒是以目的基因载体质粒中AAV2的ITRs(反向末端重复序列)作为目的基因进行扩增定量，适用于各种血清型(serotype) AAV的滴度测定。AAV的血清型取决于其衣壳蛋白的结构，也就是由包装AAV时使用的Cap基因的类型决定。通过改造AAV2 (将含有目的基因及AAV2 ITRs的载体质粒、含有目的血清型的Cap基因和AAV2 Rep基因的质粒、腺病毒辅助质粒三质粒一起转染293细胞)，即可获得不同血清型的重组AVV。因此，只要包装AAV时使用的目的基因载体质粒中的ITRs来源于AAV2，无论是哪一种血清型，都可以使用本试剂盒进行滴度测定。

本试剂盒可以精确定量。本试剂盒提供了DNase I，可以充分去除AAV包装质粒污染，并通过qPCR精确测定AAV的拷贝数，以确保后续AAV的用量准确。同时本试剂盒中含有UDG酶和dUTP，可以有效避免PCR扩增产物污染而导致的定量不准确。

本试剂盒操作快速简便。获得AAV病毒后，按照本试剂盒操作流程，先使用核酸酶去除游离核酸，再使用裂解液使蛋白质变性，即可用于滴度测定。整个操作步骤仅需约2小时即可实现AAV滴度的准确定量。

本试剂盒提供qPCR实验所需的预混液BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (防污染型)和特异性引物，预混液包含了BeyoFast™ Taq DNA Polymerase、UDG酶、PCR Buffer、dNTPs、dUTP、SYBR Green I荧光染料、稳定剂和镁离子等所有的通用组分，引物以AAV2 ITR基因序列作为靶点所设计，二者结合可用于AAV DNA的超高灵敏度定量检测。此外，本试剂盒提供Positive Control，即阳性对照，用于检测试剂盒本身是否能正常工作以及作为标准品制作标准曲线。

本试剂盒用于标准曲线检测的平均Ct值见下表，扩增曲线参考图1，拟合的标准曲线参考图2。

图1.碧云天Universal AAV Titration Kit by qPCR (C2921)用于标准品的扩增曲线图。将本试剂盒中的Positive Control进行梯度稀释，即每个反应中的质粒量分别为108 copies、107 copies、106 copies、105 copies和104 copies，然后用本试剂盒进行qPCR检测。使用Ultrapure Water作为阴性对照；NTC, negative control。实测数据可能会因样品、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

图2.碧云天Universal AAV Titration Kit by qPCR (C2921)检测后拟合的标准曲线图。将本试剂盒中的Positive Control进行梯度稀释，即每个反应中的质粒量分别为109 copies、108 copies、107 copies、106 copies、105 copies和104 copies，然后用本试剂盒进行qPCR检测。使用Ultrapure Water作为阴性对照。实测数据可能会因样品、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒提供Low ROX和High ROX，广泛兼容于无需ROX和需要Low ROX或High ROX作为校正染料的荧光定量PCR仪。ROX的作用是用于校正与PCR无关的荧光波动，从而最大限度减少孔间差异。这种差异可能由多种因素引起，如移液误差及样品蒸发等。不同的荧光定量PCR仪对ROX的要求不同，请根据实际所用仪器在配制反应体系时选择高浓度ROX (High ROX)、低浓度ROX (Low ROX)或不加ROX。常用仪器所需ROX类型请参考如下表格。

本试剂盒如果用于常规的96孔板qPCR检测(建议反应体系为20µl)或384孔板qPCR检测(建议反应体系为10µl)，本产品小包装分别可以进行50次和100次检测，中包装分别可进行200次和400次检测。

-20ºC保存，一年有效。BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X, with UDG)、Low ROX (50X)、High ROX (50X)须-20ºC避光保存，并尽量避免反复冻融。

推荐按照使用说明进行DNase I的消化，否则会因为AAV包装质粒的干扰，导致检测出来的AAV滴度偏高。

使用前需确保试剂完全融化，上下颠倒轻轻混匀后使用。混匀过程中尽量避免产生气泡。

BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X, with UDG)、Low ROX (50X)、High ROX (50X)中含有荧光染料，保存本产品或设置PCR反应时应避免强光照射，以尽量避免荧光淬灭问题。

经测试，本产品反复冻融10次对使用效果无显著影响，但仍需尽量避免反复冻融。反复冻融可能使产品性能下降。

qPCR检测是超高灵敏度的检测，请尽量在标准的PCR实验室中进行检测。PCR反应设置区域须尽量避免各种可能的扩增产物的污染。虽然本产品为防污染性，但仍建议勿在PCR反应设置区域撕开PCR封板膜或打开PCR管盖，PCR产物宜密封后按扩增后产物要求处理，以避免超高浓度的PCR产物污染实验环境。

建议使用带滤芯的吸头配制PCR体系，这样可以最大限度的避免污染导致的滴度虚高问题。推荐BeyoGold™无菌滤芯盒装吸头(FTIP631/FTIP635/FTIP638)。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。