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细胞相关> 基因表达调控> 病毒感染
产品编号: C2912M
产品包装:500ml
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价格: ¥ 2393.04
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产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
C2912S AAV-Max Lysis Buffer Plus (10X) 100ml 478.00元
C2912M AAV-Max Lysis Buffer Plus (10X) 500ml 2028.00元
C2912L AAV-Max Lysis Buffer Plus (10X) 3L 10358.00元

碧云天的AAV-Max Lysis Buffer Plus (10X),中文名增强AAV收获量细胞裂解液(10X),也称Enhanced Adeno-associated Virus Cell Lysis Buffer Plus (10X),即增强型腺相关病毒包装细胞裂解液,是一种化学成分确定(Chemical-defined, CD)的、不含任何动物源性物质(Animal origin-free, AOF)的,专用于充分裂解包装AAV用的293等细胞,以更大限度地释放AAV病毒的裂解液。本产品采用比较温和的去垢剂配方,无需额外机械破碎即可高效裂解细胞并充分释放AAV,为提取细胞中的AAV提供了一种温和、便捷且高效的方法。

腺相关病毒(Adeno-associated Virus, AAV)是Dependovirus属Parvovirus家族的微小单链DNA病毒,包含100多种血清型。AAV感染细胞后通常不会与基因组DNA重组,但可以长期稳定地表达目的基因,特别是可以在很多不分裂的细胞中长期稳定表达。AAV还具有滴度高,体内注射不产生明显的免疫反应,对于增殖和非增殖细胞感染效率高等优点,因此在生物医学领域有非常广泛的应用。

本产品的性能和用途与碧云天生产的AAV-Max Lysis Buffer (10X) (C2911)基本相同,但本产品仅一个组分,使用时仅需一步操作,进一步提升了细胞裂解和AAV提取的便捷性。

本产品操作便捷、重复性好。可以直接将本产品按照1:9的体积比加入细胞样品中,然后37ºC振荡孵育2小时,即可高效裂解细胞并释放AAV,相较于操作繁琐的反复冻融法,本产品的操作更便捷,重复性更好。

本产品提取AAV效率高。在相同条件下,使用本产品获得的AAV得率比反复冻融法要提升约114%,显著提高AAV的产率。

使用本产品、Western及IP细胞裂解液(P0013)和反复冻融法(Control)提取AAV的效果对比请参考图1。

图1.碧云天AAV-Max Lysis Buffer Plus (10X) (C2912)、Western及IP细胞裂解液(P0013)和反复冻融法(Control)提取AAV的效果对比图。Western及IP细胞裂解液(P0013)为碧云天生产的可在非变性条件下裂解细胞的裂解液。AAV包装72小时后,收集细胞和细胞培养上清,混合均匀。三组待处理样品的起始细胞量一致,分别使用反复冻融法、P0013和本产品裂解并提取AAV,裂解的终体积均保持一致。裂解完成后,所有样品均在4ºC,13,000×g离心10分钟,收集上清,即为提取的AAV。使用碧云天的Universal AAV Titration Kit by qPCR (C2921)测定AAV滴度。结果显示,AAV-Max Lysis Buffer Plus (10X)提取的AAV得率比对照组反复冻融法提升约114%,比Western及IP细胞裂解液(P0013)处理组提升约78%。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。

本产品不含TritonX-100,能更好维持AAV的结构完整性和感染活性[1]。

使用本产品提取的AAV样品,推荐使用碧云天的Universal AAV Titration Kit by qPCR (C2921)测定滴度。

本产品小包装、中包装和大包装分别可以用于900ml、4.5L和27L病毒包装细胞样品的裂解和提取。按照每10cm培养皿细胞样品量为10ml计算,本产品小包装、中包装和大包装分别可以用于90、450和2700个10cm培养皿细胞样品的裂解和提取。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
C2912S AAV-Max Lysis Buffer Plus (10X) 100ml
C2912M AAV-Max Lysis Buffer Plus (10X) 500ml
C2912L AAV-Max Lysis Buffer Plus (10X) 500ml×6
说明书 1份
保存条件:

-20ºC保存,一年有效。4ºC保存,至少一周有效。

注意事项:

为取得最佳的使用效果,AAV-Max Lysis Buffer Plus (10X)须避免反复冻融。可以适当分装后使用。

本产品使用前请仔细阅读附录《腺相关病毒使用安全规范》。本产品使用过程中涉及AAV,其生物安全等级为Biosafety Level 1 (BSL-1),没有确凿证据显示会导致健康成人产生疾病(Not known to consistently cause diseases in healthy adults),可以按照常规的微生物实验操作要求进行操作(Standard microbiological practices)。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.裂解细胞和收集AAV样品。
a.AAV包装约72小时后收集生产AAV的细胞和培养液上清。按照体积比1:9加入AAV-Max Lysis Buffer Plus (10X)。例如,在9ml样品中加入1ml AAV-Max Lysis Buffer Plus (10X)。37ºC振荡孵育2小时。
注1:细胞裂解后,裂解体系中可观察到明显的细胞碎片,属于正常现象。
注2:细胞裂解的孵育时间会因AAV血清型和生产规模不同而存在差异,如需获得最佳的效果,建议在进行大规模生产前对裂解条件适当进行优化,包括裂解液的用量和孵育时间。
b.细胞充分裂解后,小体积样品可4ºC,13,000×g离心10分钟;大规模生产样品建议4ºC,4,500×g离心30分钟。
c.离心后小心收集含有AAV的上清,并转移至适当的离心管或其它容器中。
注:后续如果需要测定AAV滴度,推荐使用碧云天的Universal AAV Titration Kit by qPCR (C2921);如果需要浓缩推荐使用通用型病毒浓缩试剂盒(C2901);如果需要浓缩和纯化,可推荐使用AAV Purification Kit Mini for All Serotypes (C2906)或AAV Purification Kit Midi for All Serotypes (C2908)。
2.AAV的储存。
收获的AAV病毒优先推荐适当分装后在-80ºC长期储存,也可放置于4ºC短期储存。
注1:AAV病毒可在4ºC下短期保存(如过夜),如果保存时间较长,可能会出现沉淀现象,这与AAV血清型和生产规模有关。如果观察到沉淀,建议按照步骤1b重新离心后再进行后续操作。
注2:为避免反复冻融对病毒稳定性和滴度造成影响,建议对病毒样品进行适当分装后保存。
注3:AAV样品解冻时,请置于室温条件下,并通过轻柔吹打或轻轻颠倒方式混匀,避免涡旋震荡或剧烈混匀。
参考文献:
1.Ma J, Su C, Hu S, Chen Y, Shu Y, et al. Mol Ther Methods Clin Dev. 2020. 19:35-46.
附录:
1.腺相关病毒使用安全规范。
a.作为一种相对安全的病毒,尽管腺相关病毒(AAV)基因组在感染后通常不会整合进入宿主细胞基因组中,也不会在细胞体内进行复制,但是仍然具有可能的潜在生物学危险。我们建议使用者在病毒操作前应仔细阅读本规范,并在实验中严格按照本规范的要求进行操作。更为严格的美国CDC的生物安全等级及其操作与防护要求参考附表1,也可以访问如下网页:https://www.cdc.gov/labs/pdf/CDC-BiosafetyMicrobiologicalBiomedicalLaboratories-2020-P.pdf
b.AAV操作时应使用相应级别的生物安全柜,不同的AAV的生物安全等级会有所不同。如果使用普通超净工作台操作病毒,请不要打开排风机,以尽量避免可能污染病毒的尘埃正面吹向操作人员而被吸入。
c.实验操作时必需佩戴一次性帽子、口罩,穿戴实验手套及专门的实验服,避免身体直接接触病毒。手部及面部有开放性创口时,禁止进行病毒操作。
d.操作病毒时需小心谨慎,不要产生气雾或飞溅。如果操作时超净工作台或其它器皿上有病毒污染,请立即用70%乙醇或2% SDS溶液擦拭干净,或者采取其它的妥善措施。
e.如果需要离心,应使用密封性好的离心管,或用封口膜密封后离心,最好使用专门的离心机。
f.用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤:拧紧培养瓶或盖紧培养板,用70%乙醇清理培养瓶或培养板外壁后到显微镜处观察拍照。离开显微镜实验台之前,用70%乙醇擦洗显微镜实验台。
g.所有被病毒污染过的枪头、离心管、培养板(皿、瓶)、培养液、手套等,在丢弃前请用84消毒液或2% SDS浸泡过夜。脱掉手套后,用肥皂或洗手液清洗双手。
h.病毒飞溅或是含有病毒的气溶胶与人体接触,须用大量清水冲洗眼睛、皮肤或粘膜等接触的部位至少15分钟。
i.含病毒的针头或是其它利器刺破皮肤,伤口应立即用10%的碘伏溶液擦洗数分钟,然后用大量清水冲洗。
附表1. 生物安全等级及其操作与防护要求
Table 1. Summary of Recommended Biosafety Levels for Infectious Agents
BSL Agents Practices Primary Barriers and
Safety Equipment
Facilities
(Secondary Barriers)
1 Not known to consistently cause diseases in healthy adults Standard microbiological practices ■ No primary barriers required.
■ PPE: laboratory coats and gloves; eye, face protection, as needed
Laboratory bench and sink required
2 ■ Agents associated with human disease
■ Routes of transmission include percutaneous injury, ingestion, mucous membrane exposure
BSL-1 practice plus:
■ Limited access
■ Biohazard warning signs
■ “Sharps” precautions
■ Biosafety manual defining any needed waste decontamination or medical surveillance policies
Primary barriers:
■ BSCs or other physical containment devices used for all manipulations of agents that cause splashes or aerosols of infectious materials
■ PPE: Laboratory coats, gloves, face and eye protection, as needed
BSL-1 plus:
■ Autoclave available
3 Indigenous or exotic agents that may cause serious or potentially lethal disease through the inhalation route of exposure BSL-2 practice plus:
■ Controlled access
■ Decontamination of all waste
■ Decontamination of laboratory clothing before laundering
Primary barriers:
■ BSCs or other physical containment devices used for all open manipulations of agents
■ PPE: Protective laboratory clothing, gloves, face, eye and respiratory protection, as needed
BSL-2 plus:
■ Physical separation from access corridors
■ Self-closing, double-door access
■ Exhausted air not recirculated
■ Negative airflow into laboratory
■ Entry through airlock or anteroom
■ Hand washing sink near laboratory exit
4 ■ Dangerous/exotic agents which post high individual risk of aerosol-transmitted laboratory infections that are frequently fatal, for which there are no vaccines or treatments
■ Agents with a close or identical antigenic relationship to an agent requiring BSL-4 until data are available to redesignate the level
■ Related agents with unknown risk of transmission
BSL-3 practices plus:
■ Clothing change before entering
■ Shower on exit
■ All material decontaminated on exit from facility
Primary barriers:
■ All procedures conducted in Class III BSCs or Class I or II BSCs in combination with full-body, air-supplied, positive pressure suit
BSL-3 plus:
■ Separate building or isolated zone
■ Dedicated supply and exhaust, vacuum, and decontamination systems
■ Other requirements outlined in the text
BSL, biosafety level; PPE, personal protective equipment.
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产品编号 产品名称 包装
C2901 通用型病毒浓缩试剂盒 可用于150ml/600ml/3L
C2906 AAV Purification Kit Mini for All Serotypes 5次/20次
C2908 AAV Purification Kit Midi for All Serotypes 5次/20次
C2911 AAV-Max Lysis Buffer (10X) 100ml/500ml/3L
C2912 AAV-Max Lysis Buffer Plus (10X) 100ml/500ml/3L
C2921 Universal AAV Titration Kit by qPCR 50次/200次
C2923 Adenovirus Titration Kit by qPCR 50次/200次
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