碧云天生物技术-铁死亡荧光检测试剂盒(RhoNox-6/CM-H2DCFDA)(C1190M)

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铁死亡荧光检测试剂盒(RhoNox-6/CM-H2DCFDA)

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产品编号	产品名称	产品包装	产品价格
C1190S	铁死亡荧光检测试剂盒(RhoNox-6/CM-H2DCFDA)	20-200次	1198.00元
C1190M	铁死亡荧光检测试剂盒(RhoNox-6/CM-H2DCFDA)	100-1000次	4289.00元

碧云天的铁死亡荧光检测试剂盒(RhoNox-6/CM-H2DCFDA)，英文名称为Ferroptosis Fluorometric Assay Kit with RhoNox-6 and CM-H2DCFDA，是一种基于亚铁离子(Fe2+)红色荧光探针RhoNox-6和活性氧绿色荧光探针CM-H2DCFDA双荧光探针组合，快速灵敏地同步检测活细胞内亚铁离子与活性氧，从而判定是否发生铁死亡的试剂盒。本试剂盒可以使用荧光显微镜进行荧光成像检测，也可以使用荧光酶标仪和流式细胞仪等进行荧光的定量检测。本试剂盒可实现对铁死亡关键标志物的实时动态监测，适用于多种铁死亡相关研究，包括铁代谢、氧化应激以及与铁死亡密切相关的疾病研究如癌症、神经退行性疾病、肾损伤、心血管损伤等，同时也可用于筛选或验证铁死亡的诱导剂或抑制剂。

铁死亡(Ferroptosis)是一种铁依赖性、与细胞凋亡不同的细胞死亡形式。铁浓度过高时，亚铁离子可通过Fenton反应催化产生羟基自由基(·OH)，进而引发脂质过氧化、蛋白质变性和DNA损伤。同时细胞膜或细胞器膜上含不饱和脂肪酸长链的磷脂分子(PUFA-PLs)被过氧化而破坏膜结构，导致膜通透性增加甚至膜破裂，最终诱发调节性细胞死亡(Regulated cell death, RCD)，也称程序性细胞死亡(Programmed cell death, PCD) [1-3]。铁死亡与癌细胞增殖调控、神经毒性损伤、神经退行性疾病进展、急性肾衰竭病理过程、药物性肝毒性反应，以及肝脏和心脏缺血/再灌注损伤修复、T细胞免疫功能调节等多种生理病理过程密切相关[4]。因此，检测细胞铁死亡对揭示细胞生理功能调控机制、解析疾病发生发展规律具有重要意义。

本试剂盒可对活细胞内亚铁离子与活性氧两个铁死亡关键标志物进行实时动态监测，从而评估铁死亡的发生与进展。细胞内亚铁离子积累和活性氧升高在铁死亡中均起关键作用，是铁死亡标志物中比较关键的两种[5]。本试剂盒中的RhoNox-6是一种新型亚铁离子(Ferrous)红色荧光探针，具有高选择性、高灵敏度、高稳定性、低细胞毒性和优异的细胞膜通透性等特点，与亚铁离子结合后，其荧光信号显著增强，从而实现对活细胞内游离亚铁离子的精准检测；CM-H2DCFDA是一种绿色的活性氧(Reactive oxygen species, ROS)探针，本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成CM-H2DCF，而CM-H2DCF不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内，后续细胞内的活性氧可以氧化无荧光的CM-H2DCF生成有绿色荧光的CM-DCF [6-7]，检测CM-DCF的荧光就可以量化细胞内活性氧的水平。

本试剂盒仅适用于活细胞的染色，不能用于固定或经膜通透处理的细胞或组织。使用荧光显微镜、荧光酶标仪和流式细胞仪检测本试剂盒染色的活细胞内亚铁离子和活性氧的效果请参考图1、图2和图3。

图1.碧云天铁死亡荧光检测试剂盒(RhoNox-6/CM-H2DCFDA) (C1190)对HeLa细胞的染色效果图。Control组为未经任何处理，Hemin组为50μM高铁血红素(≥97.0%, BioPlus) (ST1375)处理以诱导铁死亡，Inhibitor组为50μM Hemin、10mM亚铁离子螯合剂2,2'-联吡啶(99%) (Y137312)、2μM Ferrostatin-1 (Fer-1) (98%) (Y240805)进行联合抑制处理。HeLa细胞经50μM Hemin处理30分钟，因铁代谢稳态失衡引发游离亚铁离子异常蓄积，同时激活铁依赖性Fenton反应，导致细胞内ROS水平显著升高，相较于正常对照组(图B、C)，铁死亡诱导组细胞呈现红色荧光(RhoNox-6标记亚铁离子)与绿色荧光(CM-H2DCFDA标记ROS)的双重增强(图G、H)，直观反映铁死亡特征性的铁过载与氧化应激状态。当对Hemin处理的细胞进行联合抑制剂处理时，BPY通过特异性结合亚铁离子，有效阻断其与RhoNox-6探针反应，导致红色荧光信号显著降低(图L)；Fer-1通过清除脂质过氧化物自由基抑制ROS的生成，进而导致绿色荧光信号明显减弱(图M)。经Hoechst 33342染色的细胞核呈蓝色荧光(图D、I、N)，RhoNox-6、CM-H2DCFDA和亚铁离子、ROS反应后产生的红色荧光、绿色荧光和细胞核蓝色荧光的叠加(Merge)效果图分别展示于图E、J和O。实际检测效果会因实验条件、检测仪器的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

图2.碧云天铁死亡荧光检测试剂盒(RhoNox-6/CM-H2DCFDA) (C1190)用于荧光酶标仪检测的效果图。HeLa细胞使用本试剂盒染色后，使用荧光酶标仪进行检测(RhoNox-6: Ex/Em=545/585nm，波长宽度为5nm，底读；CM-H2DCFDA: Ex/Em=495/530nm，波长宽度为5nm，底读)。图A为亚铁离子的荧光信号，图B为ROS的荧光信号，相应的组别设置同图1。结果显示，Control组因细胞未发生铁死亡，胞内亚铁离子与ROS维持基础水平，RhoNox-6和CM-H2DCFDA染色后的相对荧光强度(Relative Fluorescence Intensity, RFI)均较低。经50μM Hemin处理后，细胞发生铁死亡致使细胞内的亚铁离子蓄积和ROS增加，两者的RFI值均显著高于Control组。而经联合抑制剂处理后，RFI均明显降低。实际检测效果会因实验条件、检测仪器的不同而存在差异，图中结果仅供参考。

图3.碧云天铁死亡荧光检测试剂盒(RhoNox-6/CM-H2DCFDA) (C1190)用于流式检测的效果图。HeLa细胞使用本试剂盒染色后，使用流式细胞仪的PE通道(Ex/Em=561/578nm)和FITC通道(Ex/Em=488/525nm)分别进行检测。图A为亚铁离子的荧光信号，图B为ROS的荧光信号，相应的组别设置同图1，NS组为未经任何处理且未染色的细胞。如图A、B所示，经Hemin处理的HeLa细胞红色和绿色荧光强度均较对照组显著增强，即细胞内亚铁离子、活性氧水平显著增加，而Inhibitor组荧光强度均显著降低，即细胞内亚铁离子、ROS水平显著下降。实际检测效果会因实验条件、检测仪器的不同而存在差异，图中结果仅供参考。

对于96孔板中的样品，按照每孔使用100μl RhoNox-6/CM-H2DCFDA染色液计算，本试剂盒的小包装和中包装分别可以进行200次和1000次检测；如果用于流式细胞仪检测，按照每个样品的检测体系体积为0.5ml时，本试剂盒的小包装和中包装分别可以进行40次和200次检测；对于6孔板中的贴壁培养细胞样品，按照每孔使用1ml染色液计算，本试剂盒的小包装和中包装分别可以进行20次和100次检测。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
C1190S-1	RhoNox-6 (1000X)	20μl
C1190S-2	CM-H2DCFDA (1000X)	20μl
C1190S-3	Assay Buffer	50ml
—	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
C1190M-1	RhoNox-6 (1000X)	100μl
C1190M-2	CM-H2DCFDA (1000X)	100μl
C1190M-3	Assay Buffer	250ml
—	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，一年有效。RhoNox-6 (1000X)和CM-H2DCFDA (1000X)须避光保存。

注意事项：

请酌情自备诱导/抑制细胞铁死亡的试剂，推荐选购碧云天高铁血红素(≥97.0%, BioPlus) (ST1375)、Erastin (Ferroptosis诱导剂) (SC0224)、硫酸亚铁铵六水(99.99% metals basis) (Y000832)、2,2'-联吡啶(99%) (Y137312)、Ferrostatin-1 (Fer-1) (98%) (Y240805)。

第一次使用时建议把RhoNox-6 (1000X)、CM-H2DCFDA (1000X)适当分装后保存，以避免反复冻融。

血清和酚红(Phenol red)对本试剂盒中RhoNox-6荧光探针的检测有干扰，须尽量避免。其中血清的干扰比较严重，强烈建议避免使用；酚红的存在会导致荧光背景增强，检测效果略有下降。

本试剂盒仅限于存活的细胞或组织的检测，不可用于固定或冻存的细胞或组织样品的检测。对于需要胰酶消化处理的细胞，建议先进行胰酶消化，然后再进行染色。

RhoNox-6须避免与金属离子接触。

RhoNox-6、CM-H2DCFDA在4ºC、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以20-25ºC水浴温育尽量短的时间至全部融解，并适当离心至管底后使用。

RhoNox-6、CM-H2DCFDA的工作浓度、细胞量、孵育温度和时间等可根据所使用的细胞类型及给予的特定处理预先进行适当摸索和优化，CM-H2DCFDA和RhoNox-6最优先的推荐终浓度为1X，对大多数细胞都适用，但为了得到更满意的结果，RhoNox-6和CM-H2DCFDA的浓度可在0.2-2X之间适当调整。

对于某些细胞，如果发现未处理的阴性对照细胞组CM-H2DCFDA荧光也比较强，可以按照1:2000-1:5000稀释CM-H2DCFDA再进行染色。

荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板，推荐使用碧云天BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) (FCP966)或BeyoGold™黑色透明底96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) (FCP965)。

荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.RhoNox-6/CM-H2DCFDA染色液的配制。
对于6、12、24、96孔板，每孔所需的RhoNox-6/CM-H2DCFDA染色液(RhoNox-6/CM-H2DCFDA Staining Solution)的用量分别为1ml、500μl、250μl和100μl。对于悬浮细胞样品或流式细胞仪检测，每50-100万个细胞样品需0.5ml RhoNox-6/CM-H2DCFDA染色液。根据样品数量，计算所需RhoNox-6/CM-H2DCFDA染色液的体积。以96孔板每孔100μl RhoNox-6/CM-H2DCFDA染色液的体系为例，参考下表配制RhoNox-6/CM-H2DCFDA染色液。

Reagent	1 Sample	10 Samples	100 Samples
RhoNox-6 (1000X)	0.1μl	1μl	10μl
CM-H2DCFDA (1000X)	0.1μl	1μl	10μl
Serum-free Cell Culture Medium*	100μl	1ml	~10ml
RhoNox-6/CM-H2DCFDA Staining Solution	~100μl	~1ml	~10ml

注1：配制好的RhoNox-6/CM-H2DCFDA染色液必须一次使用完毕，不能冻存。RhoNox-6/CM-H2DCFDA染色液中RhoNox-6、CM-H2DCFDA的浓度可以根据染色效果在0.2-2X之间适当调整。
注2：*血清和酚红对RhoNox-6荧光探针的检测有干扰，须避免。如果酚红不可避免，可染色后换成Assay Buffer。也可以直接使用Assay Buffer进行RhoNox-6/CM-H2DCFDA染色液的配制，但染色效果可能没有无血清无酚红的细胞培养液好。
注3：本试剂盒不提供Hoechst 33342，可根据实际需求进行选做Hoechst 33342的染色。Hoechst 33342为蓝色荧光，最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm。
2.阳性对照的诱导方法。
根据实验设计，诱导细胞内亚铁离子浓度变化可以选择使用高铁血红素(≥97.0%, BioPlus) (ST1375)、转铁蛋白(Transferrin) (ST1135/ST1136)、铁死亡诱导剂如Erastin (Ferroptosis诱导剂) (SC0224)或硫酸亚铁铵六水(99.99% metals basis) (Y000832)等。Hemin可释放铁离子诱导铁死亡，作为铁死亡诱导模型构建的阳性对照。亚铁离子螯合剂2,2'-联吡啶(99%) (Y137312)通过螯合胞内游离亚铁离子以阻断Fenton反应，而Ferrostatin-1 (Fer-1) (98%) (Y240805)作为脂溶性抗氧化剂可抑制脂质过氧化物积累，后两者分别从铁离子调控和脂质氧化抑制双通路实现对铁死亡进行特异性阻断，可作为铁离子依赖型抑制剂对照，具体处理方法如下。如果本试剂盒用于筛选或验证铁死亡的诱导剂或抑制剂，可参照进行。
a.试剂准备。
a)50µM Hemin的配制：用DMSO配制适量的100mM的Hemin储存液，保存于4ºC。使用前需平衡至室温，振荡混匀，使用时用不含血清的细胞培养液稀释至终浓度为50µM。
b)10mM BPY的配制：用DMSO配制1M的BPY储存液，保存于4ºC。使用前需平衡至室温，振荡混匀。使用时用不含血清的细胞培养液稀释至终浓度为10mM。
c)2μM Ferrostatin-1的配制：用DMSO配制10mM的Ferrostatin-1储存液，保存于4ºC。使用前需平衡至室温，振荡混匀。使用时用不含血清的细胞培养液稀释至终浓度为2μM。
注1：BPY需密封保存，避免潮解。
注2：Hemin、BPY、Ferrostatin-1对细胞的影响因细胞类型而异，因此建议根据特定的细胞适当调整使用浓度。实验前需进行预实验，确定比较适合的浓度。
b.细胞处理。
使用Hemin或Hemin+BPY+Ferrostatin-1处理待检测的细胞，置于细胞培养箱中孵育15-30分钟。仅使用Hemin处理的为阳性对照(Positive control)。根据实验需求，孵育时间可进行适当调整。孵育结束后，用HBSS轻柔洗涤细胞3次，随后可使用RhoNox-6/CM-H2DCFDA染色液进行染色。
注：细胞使用Hemin或Hemin+BPY+Ferrostatin-1处理可能对细胞活力有影响，定量检测时建议使用碧云天的CCK-8试剂盒、CellTiter-Lumi™发光法细胞活力检测试剂盒或BeyoClick™ EdU细胞增殖检测试剂盒等产品进行检测，并和本试剂盒检测结果进行校正处理(Normalization)。
3.荧光显微镜检测。
a.接种培养。将细胞接种于96孔板等多孔板、细胞培养皿中或者细胞爬片上。如有必要，按实验设计对细胞进行一定处理(如诱导铁死亡)。
b.洗涤。对于贴壁细胞，吸除培养液，酌情用HBSS轻柔洗涤细胞1-3次；对于悬浮细胞，250-1000×g室温离心5分钟，吸除上清，用HBSS轻柔洗涤1-3次。
注：对于贴壁细胞，如果需要同时检测其中的非贴壁细胞，例如诱导铁死亡后不再贴壁的细胞，每次洗涤吸除液体前须适当离心，以确保不再贴壁的细胞不会被吸走。
c.染色。加入适当体积的RhoNox-6/CM-H2DCFDA染色液。通常96孔板每孔加入100μl，24孔板每孔加入250μl，12孔板每孔加入500μl，6孔板每孔加入1ml。37ºC避光孵育30分钟。
注1：如果是首次实验不能确定孵育温度和时间，建议先尝试37ºC孵育30分钟，观察荧光效果。如果荧光强度太弱，则适当延长时间。
注2：染色后洗涤可能导致染色变弱，因此建议孵育完成后不洗涤直接进行检测，以确保检测结果的准确性。
d.检测。孵育结束后，如果使用不含血清和酚红的细胞培养液配制染色液，可以直接在荧光显微镜下观察染色效果。RhoNox-6为红色荧光，Ex/Em=545/585nm，CM-H2DCFDA为绿色荧光，Ex/Em=495/530nm。如果使用无血清但含酚红的细胞培养液配制染色液，建议根据细胞类型去除染色液，如对于贴壁细胞，需吸除染色液；对于悬浮细胞，需在室温下以250-1000×g离心5分钟，吸除上清。再加入本试剂盒提供的Assay Buffer进行检测。
4.流式细胞仪检测。
a.细胞准备。贴壁细胞胰酶消化后用培养液重悬，400×g室温离心5分钟，弃上清；悬浮细胞250-1000×g室温离心5分钟，弃上清。每个样品推荐的细胞用量为50-100万个细胞。
b.洗涤。用HBSS轻轻重悬细胞，400×g室温离心5分钟，弃上清。如有必要，可以再重复洗涤1-2次。
c.染色。对于上一步骤的50-100万个细胞的沉淀，加入0.5ml RhoNox-6/CM-H2DCFDA染色液，重悬为单细胞悬液。37ºC避光孵育30分钟。
注1：如果是首次实验不能确定孵育温度和时间，建议先尝试37ºC孵育30分钟，观察荧光效果。如果荧光强度太弱，则适当延长时间。
注2：染色后洗涤可能导致染色变弱，因此建议孵育完成后不洗涤直接进行检测，以确保检测结果的准确性。
d.检测。孵育完成后，可以直接进行流式细胞仪检测，也可以250-1000×g室温离心5分钟沉淀细胞，吸净液体后每个样品加入0.5ml Assay Buffer重悬细胞后用流式细胞仪检测。RhoNox-6为红色荧光，Ex/Em=545/585nm，推荐用PE通道(Ex/Em=561/585)进行检测，CM-H2DCFDA为绿色荧光，Ex/Em=495/530nm，推荐用FITC通道(Ex/Em=488/525nm)进行检测。
注1：使用仅含检测缓冲液的并且未经染色的细胞样品用于流式检测的阴性对照设置。
注2：由于流式检测比较灵敏，使用的荧光探针浓度可能要比荧光显微镜检测时要低，此时可根据细胞类型和实际染色情况对RhoNox-6/CM-H2DCFDA染色液稀释倍数进行适当调整。
5.荧光酶标仪检测。
a.接种培养。将细胞接种于96孔板黑色多孔板中，如BeyoGold™黑色透明底96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) (FCP965)，每孔的细胞数需要控制在1000-10,000个，通常宜在2000-5000个范围内。按实验设计对细胞进行一定处理(如诱导铁死亡)。
注：细胞接种数量需要考虑到检测时的细胞数量。如果接种后需要培养一段时间或药物处理时间比较长，则需要适当控制接种细胞数量，使检测时细胞密度为70-90%为佳。
b.洗涤。对于贴壁细胞，吸除培养液，酌情用HBSS轻柔洗涤细胞1次；对于悬浮细胞，250-1000×g室温离心5分钟，吸除上清，用HBSS轻柔洗涤1次。
注：对于贴壁细胞，如果需要同时检测其中的非贴壁细胞，例如诱导铁死亡后不再贴壁的细胞，每次洗涤吸除液体前须适当离心，以确保不再贴壁的细胞不会被吸走。由于96孔板中每孔细胞数量较少，建议仅进行一次洗涤，以减少细胞损失。
c.染色。加入适当体积的RhoNox-6/CM-H2DCFDA染色液。37ºC避光孵育30分钟。
注1：如果是首次实验不能确定孵育温度和时间，建议先尝试37ºC孵育30分钟，观察荧光效果。如果荧光强度太弱，则适当延长时间。
注2：染色后洗涤可能导致染色减弱，因此建议孵育完成后不洗涤直接进行检测，以确保检测结果的准确性。
d.检测。孵育结束后，可以直接用荧光酶标仪检测。RhoNox-6为红色荧光，Ex/Em=545/585nm，波长宽度推荐5nm或10nm。CM-H2DCFDA为绿色荧光，Ex/Em=495/530nm，波长宽度推荐5nm。贴壁细胞推荐底读，悬浮细胞顶读或底读均可。
参考文献：
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