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产品编号: C0641S
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C0641S 细胞色素C氧化酶染色试剂盒(DAB法) 500次 498.00元

碧云天的细胞色素C氧化酶染色试剂盒(DAB法),即Cytochrome C Oxidase Staining Kit with DAB,也称联苯胺法细胞色素氧化酶染色试剂盒(Cytochrome Oxidase Staining Assay Kit with DAB)、COX Staining Kit、线粒体呼吸链复合物IV染色试剂盒(Mitochondrial Respiratory Chain Complex IV Staining Kit)或复合物IV染色试剂盒(Complex IV Staining Kit),是一种基于3,3-二氨基联苯胺(3,3-Diaminobenzidine, DAB)在细胞色素C氧化酶(Cytochrome C oxidase, CO)的催化下,其侧链氨基被氧化,进行反复的氧化性聚合(Oxidative polymerization)和氧化性环化(Oxidative cyclization),形成不溶性的棕色吩嗪(Phenazine)聚合物,从而对细胞色素C氧化酶进行染色的试剂盒。本试剂盒适用于新鲜冰冻切片和细胞样品中细胞色素C氧化酶的检测。

细胞色素C氧化酶(Cytochrome C oxidase, Cox/CytOx/CcO),又称细胞色素氧化酶、线粒体复合物Ⅳ (Complex IV),是一种大型跨膜蛋白复合物,广泛存在于细菌、古细菌中,以及真核生物的线粒体中[1]。细胞色素C氧化酶是线粒体电子传递链末端的氧化酶,通过细胞色素C的电子传递与氧化磷酸化过程耦合,为细胞提供能量。一些抑制剂(如氰化物、叠氮化物和一氧化碳)与细胞色素C氧化酶结合,抑制其功能,导致细胞代谢活性的整体降低[2];一氧化氮和硫化氢与细胞色素C氧化酶上的调节位点结合,从而抑制细胞色素C氧化酶,并降低细胞的呼吸速率[3]。涉及改变细胞色素C氧化酶功能或结构的基因突变可导致严重、致命的代谢紊乱[4]。

本试剂盒使用便捷,染色效果鲜明。本试剂盒用于正常大鼠腓肠肌及HeLa细胞的染色效果请参考图1。

图1.碧云天细胞色素C氧化酶染色试剂盒(DAB法) (C0641)用于正常大鼠腓肠肌及HeLa细胞的染色效果图。正常大鼠腓肠肌细胞(冰冻切片)的染色效果见图A,HeLa细胞染色效果见图B。如图所示,细胞色素氧化酶酶活性位点(Active site of Cox)呈现较深的褐色(Brown),背景干净清晰。注:两种样品均未进行苏木素染色液染色。实际结果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。

本试剂盒染色后的结果请参考见下表。

Samples Color
Active site of Cox Brown
Background Transparent with no staining
Nuclei Blue (with Hematoxylin staining)

本试剂盒提供细胞色素氧化酶染色所需的所有试剂,包括DAB染色液、DAB增强液、DAB反应液,还同时提供苏木素染色液以帮助对细胞核(Nuclei)进行定位,细胞核呈蓝色(Blue),Cox阴性对照处理液用于阴性对照的处理。

本试剂盒可配制50ml DAB染色工作液,对于细胞样品,按照96孔板中的样品每孔使用100μl染色液计算,一个小包装本试剂盒可以检测500个样品;按照6孔板中的样品每孔使用1ml染色液计算,一个小包装本试剂盒可以检测50个样品;对于组织切片,按照每个组织需要50μl染色液计算,一个小包装本试剂盒可以检测1000个组织切片样品。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
C0641S-1 DAB染色液 40ml
C0641S-2 DAB增强液 10ml
C0641S-3 DAB反应液 50μl
C0641S-4 苏木素染色液 50ml
C0641S-5 Cox阴性对照处理液 10ml
- 说明书 1份
保存条件:

-20ºC保存,一年有效。除Cox阴性对照处理液外,其它试剂均须避光保存。苏木素染色液室温保存,一年有效。

注意事项:

DAB染色液、DAB增强液、DAB反应液须避免反复冻融,建议适当分装。

细胞色素氧化酶对固定液较为敏感,因此本试剂盒仅适用于新鲜冰冻切片及细胞样品。应尽量减少冰冻切片暴露在室温的时间。

染色工作液孵育时间因组织而异,可根据具体组织适当调整孵育时间。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.样品处理。
a.对于冰冻切片。
新鲜冰冻切片,超纯水或双蒸水洗涤2分钟。
b.对于细胞样品。
PBS (C0221A)洗涤2分钟。
2.配制DAB染色工作液。
参考下表配制DAB染色工作液,并充分混匀。DAB染色液 : DAB增强液 : DAB反应液的比例为4000:1000:4。如下按照96孔板中的样品每孔使用100μl染色液计算,具体用量需根据组织大小进行调整,配制好的DAB染色工作液须现用现配,不可冻存。
Samples 10 20 40
DAB染色液 800μl 1.6ml 3.2ml
DAB增强液 200μl 400μl 800μl
DAB反应液 0.8μl 1.6μl 3.2μl
DAB染色工作液 ~1ml ~2ml ~4ml
3.(选做)阴性对照:取相同的样品,滴加Cox阴性对照处理液,浸染约15-30分钟左右,作为阴性对照。其余步骤同正常步骤。
4.滴加适量DAB染色工作液,37ºC避光孵育约1小时。
注:染色时间可根据实际染色效果,适当延长孵育时间。
5.超纯水或双蒸水洗涤5秒。
6.(选做)滴加适量苏木素染液染细胞核5分钟。
7.自来水流水冲洗10分钟。
8.脱水、透明、封片。
a.对于冰冻切片:
(a)切片依次浸入70%乙醇10秒,80%乙醇10秒,90%乙醇10秒,无水乙醇10秒。二甲苯透明5分钟,换新鲜的二甲苯,再透明5分钟。二甲苯推荐使用环保脱蜡剂(二甲苯替代品) (ST975)替代。
(b)用中性树胶(镜检用长效封片剂) (C0173)或加拿大树胶(镜检用长效封片剂) (C0174)封片。
(c)在显微镜下观察和拍照。
b.对于细胞样品:
细胞样品请直接置于显微镜下观察拍照。如果有沉淀,可用PBS (C0221A)洗涤,再进行观察拍照。
参考文献:
1.Castresana J, Lübben M, Saraste M, Higgins DG. EMBO J. 1994. 13(11):2516–2525.
2.Alonso JR, Cardellach F, López S, Casademont J, Miró O. Pharmacol Toxicol.. 2003. 93(3):142–146.
3.Nicholls P, Marshall DC, Cooper CE, Wilson MT. Biochem Soc Trans 2013. 41(5):1312–1316.
4.Pecina P, Houstková H, Hansíková H, Zeman J, Houstek J. Physiol Res. 2004. 53 Suppl 1:S213-223.
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