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细胞凋亡-DNA Ladder抽提试剂盒(离心柱式)
产品编号: C0008
产品包装: 50次
产品价格: 451.00元
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C0008 细胞凋亡-DNA Ladder抽提试剂盒(离心柱式) 50次 451.00元

      碧云天的细胞凋亡-DNA Ladder抽提试剂盒(离心柱式)(Apoptosis, DNA Ladder Extraction Kit with Spin Column)是目前最先进的DNA Ladder抽提试剂盒之一。本试剂盒是针对细胞凋亡过程中产生的核小体间DNA链断裂而设计的。可以非常有效地抽提最小片段为180-200bp的DNA ladder,同时又可以抽提到最大50kb左右的基因组DNA。
      DNA ladder也称DNA fragmentation,是细胞凋亡的一个重要指标。通常观察到DNA ladder,就可以判定细胞发生了凋亡。
      样品首先被蛋白酶K消化,随后加入适合DNA结合到纯化柱上的缓冲液,然后加入到纯化柱内。通过高速离心,使DNA在穿过纯化柱的瞬间,结合到纯化柱上,随后通过两次洗涤去除各种杂质,最后通过洗脱液把DNA洗脱下来。整个过程无需酚氯仿抽提,无需酒精沉淀,样品裂解后仅需约15分钟即可完成。
      通过DNA纯化柱方式抽提DNA ladder比用传统的酚氯仿抽提酒精沉淀方法更加便捷,小片段DNA不容易损失。
      本试剂盒每次最多可以抽提20mg组织或200-350万个培养细胞。样品用量过多,反而会影响抽提效果。
      试剂盒提供了RNase A,可以获得不含RNA的高纯度总DNA,排除了RNA对DNA ladder观察造成的干扰。
      纯化柱对于DNA的最大容量约为30微克。通常每200万Hela细胞或500万淋巴细胞可以抽提得到15-25微克总DNA,每 25
mg 肝、脑、肾组织可以抽提得到10-30微克总DNA,每25毫克心、肺组织可以抽提得到5-10微克总DNA,每10mg脾组织可以抽提得到5-30微克总DNA。样品的用量请勿超过纯化柱的容量,样品用量最好能保持在纯化柱容量的70%或以下。当然过少的样品也不利于检测到DNA ladder。
      对于培养细胞的凋亡检测,通常6孔板一个孔的细胞就足够用于DNA ladder的抽提和检测。
      本试剂盒可以抽提50个样品。
包装清单:

产品编号 产品名称 包装
C0008-1 样品裂解液A 10ml
C0008-2 样品裂解液B 11ml
C0008-3 洗涤液I 21ml(第一次使用前加入7ml无水乙醇)
C0008-4 洗涤液II 16ml (第一次使用前加入24ml无水乙醇)
C0008-5 洗脱液 22ml
C0008-6 蛋白酶K 1.1ml
C0008-7 RNase A 220μl
C0008-8 DNA纯化柱及废液收集管 50套
说明书 1份

保存条件:
      蛋白酶K-20℃保存,其余均室温保存。一年有效。蛋白酶K室温(15-25℃)存放一周,活力无明显下降。
注意事项:
      温度较低时样品裂解液A或样品裂解液B中可能会有沉淀产生,属正常现象。使用前必须检查一遍。如有沉淀,55℃水浴孵育使沉淀溶解,混匀后使用。
       第一次使用前洗涤液I需添加7ml无水乙醇,洗涤液II需添加24ml无水乙醇,混匀,并在瓶上做好标记。
      本试剂盒需使用55℃或70℃水浴,请提前作好准备。
      除特别说明外,每次Vortex应控制在5-10秒左右。
      本试剂盒所有操作均在室温进行,操作时无需冰浴。所有离心也均在室温进行。
      废液收集管在一次抽提中需多次使用,切勿中途丢弃。
      本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
      为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.从培养的动物细胞中抽提并检测DNA ladder
a.收集约100万个细胞,离心沉淀,弃上清。加入200微升PBS,轻轻吹散或弹散细胞,使细胞重悬于PBS中。
需自备PBS。如果使用冻存的细胞沉淀,先把细胞沉淀解冻,并轻轻弹散,然后再加入PBS重悬细胞。
b.加入4微升RNase A,Vortex混匀。室温(15-25℃)放置3-5分钟。
c.加入20微升蛋白酶K,Vortex混匀。
d.加入200微升样品裂解液B,Vortex混匀。70℃孵育10分钟。
加入样品裂解液B后必须立即Vortex混匀。不可把蛋白酶K直接和样品裂解液B混合。
e.加入200微升无水乙醇,Vortex混匀。
加入乙醇后必须充分混匀,否则会严重影响抽提效果。加入乙醇后可能产生白色沉淀,属正常现象,后续步骤中必须把白色沉淀和溶液全部转移到纯化柱内。
f.把步骤e中的混合物加入到DNA纯化柱内。≥6000g(约≥8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
注意:必须把沉淀全部转移到DNA纯化柱内,否则会严重影响抽提效果!
g.加入500微升洗涤液I,≥6000g(约≥8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
h.加入600微升洗涤液II,≥18000g(约≥12000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
进行本步骤前需把纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
i.再≥18000g(约≥12000rpm)离心1分钟,以去除残留的乙醇。
不可把步骤h的离心时间延长而省略本步骤。倒弃废液后再离心可以确保充分去除残留的乙醇。
j.将DNA纯化柱置于一洁净的1.5ml离心管上,加入50-100微升洗脱液。室温放置1-3分钟。≥12000rpm离心1分钟。所得液体即为纯化得到的总DNA。
洗脱液需要直接加至纯化柱管内柱面中央,使液体被纯化柱吸收。如果有必要,可以使用去离子水或TE进行洗脱。使用较小体积的洗脱液可以使获得的总DNA的浓度较高,但洗脱下来的DNA量相对较少。
k.取部分抽提得到的DNA,1%琼脂糖凝胶电泳分析。如果细胞发生凋亡,即可观察到典型的DNA ladder。电泳时一定要注意换用新鲜配制的电泳液,DNA凝胶也要用新鲜配制的电泳液配制并新鲜配制后使用。电泳时为获取最佳的电泳效果使ladder充分分开,电泳速度宜适当慢一些,凝胶宜适当长一些,而加样孔宜更加扁平一些。选取适当较薄的梳齿,往往会获得更好的ladder电泳效果。
2.从动物组织中抽提并检测DNA ladder
a.取不超过25mg的组织(脾不超过10mg),剪切成尽可能小的碎片,加入180微升样品裂解液A。
请勿使用过多的样品,过多的样品会导致抽提效果下降。较小的组织碎片会使裂解速度加快,裂解效果提高。新鲜或冻存的组织均可,但固定过的组织请参考后续的其它步骤进行。
b.加入20微升蛋白酶K,Vortex混匀,55℃水浴孵育至完全裂解。
在孵育期间可以偶尔取出样品Vortex以加快裂解速度。裂解的时间因组织不同而有所不同,通常可在1-3小时内完成。为方便起见,可以直接裂解过夜,裂解过夜对抽提效果无任何负面影响。组织完全裂解后可以呈粘稠状,但不应该呈可把DNA纯化柱堵住的凝胶状。如果消化过夜仍呈凝胶状,说明样品用量过多,作为补救措施,可以把整个反应体系放大一倍。
c.加入4微升RNase A,Vortex混匀。室温(15-25℃)放置3-5分钟。
d.最高速剧烈Vortex 15秒。加入200微升样品裂解液B,Vortex混匀。70℃孵育10分钟。
加入样品裂解液B后需立即Vortex混匀。加入样品裂解液B后可能会产生白色沉淀,但大多数情况在70℃孵育后会溶解。即使70℃孵育后仍有白色沉淀也不会干扰后续实验。有些组织例如肺、脾,在加入样品裂解液B后可能会形成凝胶状物,此时需剧烈晃动或Vortex样品,以尽量破坏凝胶状物。
e.转步骤1.e,后续步骤同“从培养的动物细胞中抽提总DNA”1.e起的步骤。
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使用本产品的文献:
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