我们上周刚刚推出了Bio-Lumi™萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒产品，一经推出受到了大家的广泛关注。（了解详情请点击：萤光素酶报告基因检测试剂盒再添新品：ADCC Reporter检测理想选择！）。
今天就来和大家浅谈一下萤光素酶报告基因检测技术吧！

什么是报告基因？

报告基因（Reporter Gene）技术是常用于检测转录因子转录活性，或启动子、增强子等及其中的转录调控元件活性、或者5’或3’-UTR等及其中的调控元件活性的重要技术。
报告基因既可以用于检测反式作用因子(trans-element)如转录因子等的活性，也可以用于检测顺式作用因子(cis-element)如DNA中的转录因子结合位点、mRNA的3’-UTR中miRNA结合位点等的调控活性[1]。

理想的报告基因须具备以下几个条件：
1.表达产物必须与细胞内源基因相区别，编码产物的活性不受宿主细胞的干预。
2.报告基因编码产物的检测快速简便、经济、灵敏高，且重现性好、结果可靠，测量数据应该有较宽的线性范围。
3.细胞内的其它基因产物不会干扰报告基因产物的检测，同时报告基因的表达也不改变宿主细胞的生理功能。
常用的报告基因有：氯霉素乙酰转移酶 （CAT），β半乳糖苷酶（β-gal或LacZ），萤光素酶（Luciferase）以及EGFP等荧光蛋白。其中萤光素酶报告基因具有检测便捷、灵敏度高、线性范围宽、可以进行活细胞和活体检测等优点，使用非常广泛[2]。

什么是萤光素酶？

萤光素酶是自然界中能够产生生物萤光的酶的统称。萤光素酶可以催化萤光素氧化成氧化萤光素，在萤光素氧化的过程中，会发出生物萤光。然后可以通过萤光测定仪(化学发光仪)测定过程中释放的生物萤光(化学发光)。目前，最有代表性的是从萤火虫中分离得到的萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）和从海肾中分离得到的海肾荧光素酶（Renilla luciferase），还有近年来研究较多的来源于夏威夷水域的一种大型海洋桡脚类(Copepod)动物获得的Gaussia Luciferase。

▶   萤火虫萤光素酶（Firefly luciferase）是一种分子量约为61kD的蛋白，在ATP、镁离子和氧气存在的条件下，可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出波长为560nm左右的生物萤光(bioluminescence)，是目前体内外检测实验中最常用的萤光素酶。在此基础上还有用于高灵敏度检测的快速降解型萤火虫荧光素酶，例如pGL6-TA-CP(超灵敏快速降解型报告基因质粒) (D2094)。
▶   海肾萤光素酶（Renilla luciferase）是一种分子量约为36kD的蛋白，在氧气存在的条件下，可以催化腔肠素(Coelenterazine)氧化成Coelenteramide，反应过程无需ATP和镁离子参与。在Coelenterazine氧化的过程中，会发出波长为480nm左右的生物萤光(bioluminescence)。
▶   Gaussia Luciferase为单条肽链的单体酶，其分子量较小(20kD)，且具有分泌性信号肽，可通过内质网分泌到细胞外。因此在使用Gaussia Luciferase的报告基因载体转染哺乳动物细胞进行表达时，无需裂解细胞，可直接使用细胞培养基上清进行萤光素酶活性的实时检测。Gaussia Luciferase萤光素酶参与催化底物腔肠素的氧化反应并且发出波长为480nm左右的萤光。

与其它萤光素酶相比，Gaussia Luciferase作为报告基因有多方面的优势：
1.分泌型萤光素酶，可在不同时间段直接取上清检测，无须裂解细胞；
2.发光强度高，是其它萤光素酶的1000倍；
3.反应无须ATP，不受ATP影响；
4.稳定性高，对温度、pH值等耐受性强。

图1. 萤光素酶的反应原理图

实验原理

转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，转录因子与其靶启动子中的特异性识别序列结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。借助萤光素和萤光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测荧光素酶的表达水平。从而可以用于检测转录因子的活性，基因启动子、增强子等及其调控元件的活性或者mRNA中5’或3’-UTR中的相关调控元件活性。
其具体的研究思路简述如下：
（1） 构建一个将特定启动子或增强子，或特定待研究的调控元件插入到萤光素酶表达序列前方的报告基因质粒。进一步借助相应调控元件的突变研究，此时可以用于研究基因启动子、增强子等及其调控元件的活性了。
（2） 构建一个包含多个已知转录因子结合位点的报告基因质粒，例如pNFκB-TA-luc (D2207)，这样就可以用于研究细胞中NFκB这个转录因子的转录激活水平了。
（3） 构建一个包含mRNA 3’-UTR的报告基因质粒，推荐使用pGL6-miR (D2106)，把3’-UTR放在luciferase的后边，转录后luciferase mRNA的稳定性和转录活性就会受该3’-UTR的调控。通过3’-UTR的点突变等，就可以研究3’-UTR的调控作用以及miRNA对于该3’-UTR的调控了。
（4） 通常将上述的报告基因质粒转染细胞。如果此转录因子能够激活靶序列，则萤光素酶基因就会表达，萤光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。3’-UTR等可以调控mRNA的稳定性和翻译活性，最终的调控活性也和荧光素酶的活性正相关。
（5）加入特定的萤光素酶检测试剂，萤光素酶与底物反应，产生萤光，通过检测萤光的强度可以测定萤光素酶的活性。

图2. 萤光素酶报告实验图解

在用萤光素酶定量基因表达时，通常会采用第二个报告基因作为内参，使第一个报告基因的检测均一化，从而减少实验的变化因素干扰。例如, 培养细胞的数目和活力的差别, 细胞毒性，细胞转染和裂解的效率等。由于萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶，具有不同的催化底物和萤光颜色，互不干扰，因此通常以萤火虫萤光素酶为报告基因，海肾萤光素酶使用组成型启动子作为内参基因，形成双萤光素酶报告基因系统。

双萤光素酶报告实验过程如下图所示。

图3 双萤光素酶报告基因实验流程

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碧云天可提供多款萤光素酶报告基因检测试剂盒，包括一步法检测试剂盒：Bio-Lumi™（RG042/43）、Bright-Lumi™（RG051/52）、One-Lumi™（RG055/56）、Steady-Lumi™（RG058/59）、Renilla-Lumi™（RG062/66）、Dual-Lumi™（RG088）及两步法检测试剂盒：萤火虫萤光素酶检测试剂盒（RG005）、海肾萤光素酶检测试剂盒（RG016）、双萤光素酶检测试剂盒（RG027）等多个系列产品，稳定性好，灵敏度高，系列中不同产品各有所长，效果可媲美国际一线大牌产品，即用型液体使用方便，冻干粉包装，长久保存更稳定。

不同萤光素酶报告基因检测试剂盒的特点和比较见下表，大家可以根据实验需求进行选择。
一步法即用型萤光素酶检测试剂盒系列：

一步法冻干粉型萤光素酶检测试剂盒系列：

两步法萤光素酶检测试剂盒系列：

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同时还有多种新型Gaussia Luciferase萤光素酶系列报告基因检测质粒，该系列质粒具有氨苄青霉素抗性，所有可以被预测出的可能的转录因子结合位点全部进行了适当的突变处理，在保持原有功能不变的情况下，使各种转录因子在质粒上的非特异性结合降到最低。助力您的报告基因检测实验！
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此外我们也推出了Lenti-EF1α-Luc-T2A-Puro萤光素酶示踪用重组慢病毒，其采用复制缺陷型慢病毒，可以在大多数哺乳动物细胞（包括原代细胞和干细胞）中通过EF1α启动子适度表达组成型萤火虫萤光素酶和嘌呤霉素抗性基因，感染效率高，品质保证，安全可靠！
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碧云天还可提供双萤光素酶报告基因实验技术服务，详情可通过服务热线或邮箱进行咨询。
服务热线：400-168-3301转6号键
邮箱咨询：service@beyotime.com

应用案例：
案例一：
2022年5月3日，中国科学院上海药物研究所柳红课题组和黄河课题组在《Cell Metabolism》（IF 31.373）发表了题为“Identification and evaluation of a lipid-lowering small compound in preclinical models and in a Phase I trial”的研究成果。 研究人员报道了一种含有吲哚的四氢异喹啉化合物DC371739化合物，其在体内外均具有良好的降脂作用， 并且在I期临床试验中具有良好的耐受性(NCT04927221)。DC371739在多种动物模型中都显著降低了总胆固醇、低密度脂蛋白和甘油三酯的血浆水平，并在I期试验中也表现出初步的阳性结果。从作用机制上来说，DC371739作用方式与其他已知的降脂药机制不同。 DC371739能够与HNF-1α结合，阻碍PCSK9和ANGPTL3的转录，已知这两种基因会导致高胆固醇血症和血脂异常。并且由于DC371739与其他他汀类药物作用机制不同，因此其能够与阿托伐他汀等药物联合使用，从而更好地改善受试者患者异常，为他汀类药物不耐受的患者提供潜在的替代治疗方案。
该研究团队使用碧云天双萤光素酶报告基因检测试剂盒（RG027），验证了DC371739对PCSK9转录的调控作用[3]。
此外，该研究还使用了多种碧云天高品质产品，包括RIPA裂解液(强)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)、细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒等。

案例二：
2021年8月11日，上海交通大学医学院仁济医院上海癌症研究所癌基因及相关基因国家重点实验室在《Nature Communications》（IF 17.694）发表了题为“USP12 downregulation orchestrates a protumourigenic microenvironment and enhances lung tumour resistance to PD-1 blockade”的研究成果。研究人员发现了一种去泛素化酶USP12，其通常在KrasG12D诱导的小鼠肺癌和人非小细胞肺癌中表达下调。USP12的下调能够促进肺癌肿瘤的生长，并通过招募更多巨噬细胞、阻止T细胞活化从而形成免疫抑制的肿瘤微环境。机制研究表明，USP12下调会导致肿瘤细胞中PPM1B去泛素化异常，引起NF-κB超活化，从而形成致癌分泌蛋白质组。同时USP12还能抑制小鼠肺癌细胞对于抗PD-1免疫治疗的敏感性。总体而言，本研究发现一个在调节肿瘤-免疫细胞相互作用和肿瘤免疫检查点封锁治疗敏感性的关键组成元件，为提高肺癌肿瘤免疫疗效提供了理论基础。
该研究团队使用碧云天双萤光素酶报告基因检测试剂盒（RG027）用于探究USP12对NF-κB的转录调控作用[4]。
此外，该研究还使用了多种碧云天高品质产品，包括RIPA裂解液(强)、Western及IP细胞裂解液、Ionomycin (钙离子载体)等。

参考文献：
[1] Vande Velde G, Himmelreich U, Neeman M. Reporter gene approaches for mapping cell fate decisions by MRI: promises and pitfalls. Contrast Media Mol Imaging. 2013
[2] Chen Y, Xu Z, Wu D, et al. Luciferase reporter gene assay on human 5-HT receptor: which response element should be chosen?. Sci Rep. 2015
[3]Wang J, Zhao J, Yan C, et al. Identification and evaluation of a lipid-lowering small compound in preclinical models and in a Phase I trial. Cell Metab. 2022
[4]Yang, Z., Xu, G., Wang, B. et al. USP12 downregulation orchestrates a protumourigenic microenvironment and enhances lung tumour resistance to PD-1 blockade. Nat Commun . 2021