呼吸道过敏性疾病如哮喘、花粉热(过敏性鼻炎)等是发病率呈上升趋势的常见疾病。当患者暴露于环境中的过敏原（如室内尘螨、霉菌、细菌、植物花粉和动物皮屑等）时，这些疾病通常会加重。某些来自过敏原的酶活性成分，包括来自HDMs的Der p和Der f，米曲霉的Asp f或芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶，可以诱导细胞因子的释放，加剧过敏反应。

白介素-33 (Interleukin-33, IL-33)是一种上皮细胞来源的细胞因子，可快速响应环境损伤，在引发气道炎症疾病中起关键作用。然而，暴露于过敏原后IL-33分泌的分子机制尚不清楚。

2022年7月6日，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心/生物化学与细胞生物学研究所孙兵，张亚光，广东医科大学吴斌及吴东共同通讯在Nature Immunology（IF:31.25）杂志上发表了题为 Allergen protease-activated stress granule assembly and gasdermin D fragmentation control interleukin-33 secretion 的研究论文，破译了过敏反应中IL-33分泌的分子机制。该研究发现两个细胞事件是接触过敏原后IL-33分泌的基础：1.应激颗粒（Stress granules, SGs）组装的激活控制IL-33从细胞核向细胞质运输；2.p40 NT-Gsdmd (Gasdermin D通过不依赖半胱天冬酶的机制被切割成p40 N-末端的形式)片段的产生可以在细胞膜上形成孔道，促进 IL-33 从细胞质分泌到细胞外。阻断任一事件均可有效阻止IL-33在小鼠上皮细胞中的释放。该研究为IL-33依赖的过敏性气道炎症的治疗提供了新策略。

主要结果解读

首先，研究人员通过免疫荧光和免疫印迹等方法发现，木瓜蛋白酶（过敏原）能够通过非经典细胞死亡方式（如凋亡、坏死等）刺激IL-33分泌到细胞外，并且诱导p40 NT-Gsdmd片段的激活（Gsdmd片段化）。此外，研究者发现，木瓜蛋白酶的刺激并没有促进p20 caspase-1的激活，也没有诱导IL-1β的分泌，但却诱导小鼠骨髓源巨噬细胞（BMMs）中p40 NT-Gsdmd的生成和IL-33的释放，且并未导致明显的LDH释放。而用木瓜蛋白酶处理Gsdmd缺失的BMMs发现IL-33分泌受损，表明IL-33的分泌需要Gsdmd的参与。使用木瓜蛋白酶处理caspase-1和caspase-11双缺失的BMMs发现仍然有p40 NT-Gsdmd产生和IL-33的分泌，说明p40 NT-Gsdmd的生成与IL-33的释放是不依赖caspase-1/11途径的。

接下来，研究人员分析了Ras-GTPase激活蛋白G3BP1（该蛋白在A549-IL-33-GFP细胞中通过形成multimer来触发SGs组装）的定位，去确定SG组装是否参与了过敏原蛋白酶诱导的IL-33释放。观察发现，亚坤酸盐和木瓜蛋白酶处理均能使IL-33与G3BP1点状突起共定位，且亚坤酸盐能够促进IL-33的核质转移，但不诱导IL-33的分泌，而木瓜蛋白酶可以诱导IL-33从细胞核直接分泌到细胞外。IP分析发现，与未受刺激的细胞相比，木瓜蛋白酶和亚坤酸盐处理的MLE-12细胞中G3BP1和IL-33的相互作用增加。然后，研究人员从亚砷酸盐或木瓜蛋白酶刺激的小鼠气道上皮MLE-12细胞中收集细胞培养上清和全细胞裂解液(WCL)，用超离心法分离出SGs。免疫印迹分析发现，木瓜蛋白酶处理的上清中能够检测出IL-33，而亚坤酸盐条件下只能在全细胞裂解液（WCL）和SGs浓缩物中检测到IL-33。在HEK293T细胞中，经亚砷酸盐(依赖eIF2α)或d-山梨醇(不依赖eIF2α)刺激后，异位表达的IL-33从细胞核迁移到胞质中，表明SG组装可以依赖或独立于p-eIF2α。IP-MS分析表明，亚砷酸盐和木瓜蛋白酶刺激促进了几种常见的非膜结合，细胞器组装相关成分的富集，包括G3BP1, KPNB1和ATXN2L。用亚砷酸盐或d-山核桃醇或其他刺激因素处理MLE-12细胞，诱导了SG组装，但没有诱导p40 NT-Gsdmd或IL-33的分泌。

此外，与未受刺激的细胞相比，亚砷酸盐可促进eIF2α磷酸化，而与亚砷酸盐处理或未受刺激的MLE -12细胞相比，木瓜蛋白酶刺激并没有改变eIF2α或p-eIF2α的数量，但增加了eIF4A1的降解，从而抑制了SG组装。综合应激反应抑制剂(ISRIB)抑制eIF2α下游SG组装，但不影响p40 NT-Gsdmd的激活和IL-33的释放。同时使用放线菌素D和木瓜蛋白酶处理细胞，发现IL-33分泌减少和p40 NT-Gsdmd片段减少，表明木瓜蛋白酶刺激触发了不依赖p- eIF2α的SG组装通路。且研究人员免疫荧光分析了多种过敏原蛋白酶刺激，发现均能够激活SG组装。这些数据表明，蛋白酶激活的SG组装是控制IL-33核质转运的必要条件。

随后，研究人员研究了p40 NT-Gsdmd是否促进胞质IL-33的胞外分泌。研究人员使用在线预测工具ProP 1.0来预测Gsdmd中潜在的切割位点，根据预测结果构建了3个N端带有flags标记的小鼠Gsdmd片段(Gsdmd^{1 - 311}、Gsdmd^{1 - 394}和Gsdmd^{1 - 409})。caspase-1/11处理的Gsdmd^1-276作为阳性对照，全长的Gsdmd (GsdmdFL)作为非功能对照，发现Gsdmd^1-276和Gsdmd^1-311的表达能高效诱导IL-33的分泌，而其他表达片段则不能诱导IL-33的分泌。通过点突变和缺失实验验证，发现氨基酸309-313残基(ELRQQ)突变或缺失阻断了p40 NT-Gsdmd的生成，并阻止了木瓜蛋白酶刺激的MLE12细胞中IL-33的分泌，表明该序列对p40 NT-Gsdmd的生成是必要的。

为了确定p35 NT-GSDMD片段在人类细胞中的特异性裂解位点，研究人员将GSDMD片段GSDMD^1-290、GSDMD^1-320和GSDMD^1-327以及细胞焦亡介导片段GSDMD^1-275克隆到表达GFP的四环素表达载体中，并在HEK293T细胞中表达。发现GSDMD^1-290诱导的LDH释放水平低于GSDMD^1-275片段。四环素诱导表达后，与GSDMD^1-275相似，GSDMD^1-290能高效促进IL-33释放到上清液中，而其他结构体不具备这一功能。为了确定特异的GSDMD切割位点，研究人员又构建了几个突变接近aa 290的Flag-tagged GSDMD表达载体，并转染到GSDMD缺陷的HeLa细胞中。aa 288-292 (GLRAE)突变为AAAAA后，木瓜蛋白酶处理后p35 NT-GSDMD的生成受阻，说明p35 NT-GSDMD的切割位点位于该区域。同时删除R290和L289也有效地阻止了p35 NT-GSDMD的生成。上述结果表明，人GSDMD^1-290可促进细胞内IL-33分泌到上清液中。

结论

该证明了在过敏原蛋白酶暴露的情况下，两个细胞事件依次调节IL-33的分泌。首先，气道上皮细胞SG组装的激活允许IL-33的核质转运，但不控制其分泌。其次，Gsdmd在aa 309-313位点的裂解(ELRQQ)产生p40 NT-Gsdmd，促进胞质IL-33跨膜进入细胞外间隙。此外，该研究还发现GSDMD在人气道上皮中有较高的表达，并与哮喘患者BALF中IL-33分泌增加有关，提示GSDMD可能参与哮喘的发病机制。

使用产品

在该研究中使用了多款碧云天的产品，包括Lactate Dehydrogenase Rabbit Monoclonal Antibody（AF1660）、细胞程序性坏死诱导试剂盒(C1058)、细胞凋亡诱导试剂盒(TNF-α+SM-164)(C0006)、细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0027)等。

产品信息：

产品编号	产品名称	包装
AF1660	Lactate Dehydrogenase Rabbit Monoclonal Antibody	50μl
C1058	细胞程序性坏死诱导试剂盒	100次/500次
C0006	细胞凋亡诱导试剂盒(TNF-α+SM-164)	100次
P0027	细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒	50次