CRISPR/Cas9基因敲除技术服务 T7E1验证CRISPR/Cas9基因敲除用慢病毒，低至8888元！
T7E1验证CRISPR/Cas9基因敲除细胞株，低至9999元！！！

本技术服务提供基于CRISPR/Cas9技术的目的基因敲除用慢病毒或目的基因敲除的指定细胞株，并且无论是慢病毒和细胞株都经过金标准T7E1法的验证。特别是目的基因敲除的多克隆细胞株，仅需30天即可获得并可用于目的基因敲除后的功能检测。

碧云天CRISPR/Cas9基因敲除技术服务项目表 碧云天CRISPR/Cas9基因敲除技术服务项目表：
服务项目 项目编号 全额预付特价(元) 半额预付特价(元) 零首付价(元)
CRISPR/Cas9基因敲除用慢病毒
(无T7E1验证)		 T0405 8555 9555 10555
CRISPR/Cas9基因敲除用慢病毒
(T7E1验证)		 T0408 8888 9888 10888
CRISPR/Cas9基因敲除多克隆细胞株
(T7E1验证)		 T0411 9999 10999 11999
CRISPR/Cas9基因敲除多克隆细胞株
(T7E1验证、WB验证)		 T0413 11111 12222 13333
CRISPR/Cas9基因敲除单克隆细胞株
(双等位基因敲除)		 T0418 19999 21000 23000
敲除用慢病毒与敲除多克隆细胞株 T0421 15666 17222 18777
相同基因敲除用慢病毒再次订购 T0423 4598 5058 5518
相同基因敲除多克隆或单克隆细胞株再次订购 T0425 1268 1395 1522
其它CRISPR/Cas9相关技术服务 T0437 询价 询价 询价
100个定制基因敲除细胞裂解液 T0438 询价 询价 询价
100个定制基因敲除细胞株 T0439 询价 询价 询价
碧云天CRISPR/Cas9技术服务优势：
  1. 技术新：基于最新的CRISPR/Cas9技术，有效敲除目的基因并避免脱靶效应。
  2. 标准严：可以提供经过金标准T7E1法验证的慢病毒或细胞株，也可以提供经过Western blot验证的多克隆细胞株。
  3. 筛选快：碧云天自行研发了基于CRISPR/Cas9技术的sgRNA快速筛选和验证体系，确保了可以在最短的时间内完成sgRNA的筛选和T7E1法验证，同时也降低了筛选成本。
  4. 时间短：目的基因敲除的多克隆细胞株仅需30工作日即可完成；单克隆细胞株一般在60工作日完成。
  5. 价格低：CRISPR/Cas9基因敲除多克隆细胞株低至11111元，基因敲除用慢病毒低至8888元。
碧云天CRISPR/Cas9技术服务选购建议：
  1. 对于CRIPR/Cas9技术不是很熟悉的用户，我们优先推荐选择T0411或T0413直接获取目的基因敲除的多克隆细胞株，这样就直接可以开始目的基因敲除后的功能研究了。希望在多个细胞株中研究目的基因敲除后的功能时，我们优先推荐选择T0411和T0428或T0413和T0431。T0413和T0431增加了Western blot验证，敲除效果更有保障。
  2. 对于CRISPR/Cas9技术比较熟悉，能自行进行多克隆或单克隆细胞株的筛选并能自行进行T7E1鉴定的，在经费许可的情况下我们优先推荐选择T0408，仅当经费比较紧张的情况下可以考虑选择T0405。需要注意的是，T0405尽管经过我们的筛选，很可能后续T7E1验证会取得成功，但我们无法保证后续T7E1验证一定成功。希望在多个细胞株中研究目的基因敲除后的功能时，在经费许可的情况下我们优先推荐选择T0411和T0428，或T0413和T0431，仅当经费比较紧张的情况下可以考虑选择T0408或者T0405。对于T0408和T0405，我们推荐选择经过T7E1验证的T0408。仅当需要对大量基因进行基于CRISPR/Cas9技术的基因敲除时，可以考虑选择T0405，此时可以节省一些费用并总是会检测到大部分基因被顺利敲除的。
  3. 对于经费充足的情况下可以考虑选择T0418，直接获得经过测序验证的单克隆双等位基因敲除细胞株，省心省力。
碧云天CRISPR/Cas9技术服务流程：
  1. 用户下载并填写CRISPR/Cas9技术服务协议书，发送至service@beyotime.com。
  2. 双方确认并签订技术服务协议书，按照协议内容进行技术服务。
碧云天CRISPR/Cas9技术服务项目明细：

T0405 CRISPR/Cas9基因敲除用慢病毒(无T7E1验证) 全额预付特价8555元，30天内保证完成。 基于CRISPR/Cas9技术，提供一种经特有技术验证的目的基因敲除用慢病毒(含对照病毒)。 技术标准：提供一种经验证的能表达靶向目的基因的sgRNA和Cas9并能有效敲除目的基因的慢病毒。该慢病毒有puromycin抗性，感染细胞后可以用puromycin筛选目的基因敲除的细胞株，不保证T7E1验证效果和Western检测效果。最终提供靶向目的基因的慢病毒108 IU (Infectious Units)，靶向GFP的对照慢病毒或无任何靶向的对照慢病毒(任选一个)108 IU；报告单一份(含提交物品清单和病毒感染方法等)。 下载并填写CRISPR/Cas9技术服务协议书

T0408 CRISPR/Cas9基因敲除用慢病毒(T7E1验证) 全额预付特价8888元，30天内保证完成。 基于CRISPR/Cas9技术，并经金标准T7E1验证的目的基因敲除用慢病毒(含对照病毒)。 技术标准：提供一种经验证的能表达靶向目的基因的sgRNA和Cas9并能有效敲除目的基因的慢病毒。该慢病毒有puromycin抗性，感染细胞后可以用puromycin筛选目的基因敲除的细胞株，有相应模式细胞的T7E1验证结果，但不保证Western检测效果。最终提供靶向目的基因的慢病毒108 IU (Infectious Units)；靶向GFP的对照慢病毒或无任何靶向的对照慢病毒(任选一个)108 IU；报告单一份(含提交物品清单、相应模式细胞的T7E1验证结果和病毒感染方法等)。 下载并填写CRISPR/Cas9技术服务协议书

T0411 CRISPR/Cas9 基因敲除多克隆细胞株(T7E1验证) 全额预付特价9999元，30天内保证完成。 基于CRISPR/Cas9技术，并经金标准T7E1验证的目的基因敲除多克隆细胞株(含对照细胞株)。 技术标准：提供经验证的一个通过CRISPR/Cas9技术把目的基因敲除的定制细胞株(多克隆，可以用于目的基因的功能研究)。最终提供感染靶向目的基因的Cas9慢病毒后筛选获得的多克隆细胞2管，每管细胞数量不少于100万；感染靶向GFP的对照慢病毒或无任何靶向的对照慢病毒(任选一个)后筛选获得的对照细胞2管，每管不少于100万；包含目的基因敲除的T7E1验证结果的报告单一份(含提交物品清单、T7E1验证结果和细胞培养方法等)。 下载并填写CRISPR/Cas9技术服务协议书

T0413 CRISPR/Cas9 基因敲除多克隆细胞株(T7E1验证、WB验证) 全额预付特价11111元，30天内保证完成。 基于CRISPR/Cas9技术，并经金标准T7E1验证和WB验证的目的基因敲除多克隆细胞株(含对照细胞株)。 技术标准：提供经验证的一个通过CRISPR/Cas9技术把目的基因敲除的定制细胞株(多克隆，可以用于目的基因的功能研究)。最终提供感染靶向目的基因的Cas9慢病毒后筛选获得的多克隆细胞2管，每管细胞数量不少于100万；感染靶向GFP的对照慢病毒或无任何靶向的对照慢病毒(任选一个)后筛选获得的对照细胞2管，每管不少于100万；包含目的基因敲除的T7E1和WB验证结果的报告单一份(含提交物品清单、T7E1和WB验证结果、细胞培养方法等)，其中WB验证用户需提供有效的相应一抗。 下载并填写CRISPR/Cas9技术服务协议书

T0418 CRISPR/Cas9基因敲除单克隆细胞株(双等位基因敲除) 全额预付特价19999元，60天完成。 基于CRISPR/Cas9技术，并经测序验证的目的基因敲除单克隆细胞株(双等位基因敲除)。 技术标准：提供经验证的一个通过CRISPR技术把目的基因敲除的定制细胞株(单克隆，双等位基因敲除，经测序验证)。最终提供感染靶向目的基因的Cas9慢病毒后筛选获得的单克隆细胞2份，每份细胞数量不少于100万；感染靶向GFP的对照慢病毒或无任何靶向的对照慢病毒(任选一个)后筛选获得的对照细胞2管(非单克隆)，每份不少于100万；包含报告单一份(含提交物品清单、测序结果和细胞培养方法等)。 下载并填写CRISPR/Cas9技术服务协议书

T0421敲除用慢病毒与敲除多克隆细胞株 全额预付特价15666元，30天内保证完成。 靶向同一个基因的基于CRISPR/Cas9技术的慢病毒和目的基因敲除的多克隆细胞株(含对照细胞株)。 技术标准：靶向同一个基因的基于CRISPR技术能有效敲除目的基因的慢病毒和基于CRISPR技术的目的基因敲除细胞株。相当于靶向同一基因时，服务T0407和T0411的打包服务。最终提供的实验结果为T0407和T0411技术标准之和。 下载并填写CRISPR/Cas9技术服务协议书

T0423相同基因敲除用慢病毒再次订购 全额预付特价4598元，15天内保证完成。 再次订购之前相同的基于CRISPR/Cas9技术能有效敲除目的基因的慢病毒(含对照病毒，仅限同一订购单位的同一订购人)。 技术标准：同T0405或T0407。 下载并填写CRISPR/Cas9技术服务协议书

T0425相同基因敲除多克隆或单克隆细胞株再次订购 全额预付特价1268元，7天内保证完成。 再次订购之前相同的基于CRISPR技术能有效敲除目的基因的多或单克隆细胞株(含对照细胞株，仅限同一订购单位的同一订购人)。 技术标准：同T0411、T0413、T0415或T0417。 下载并填写CRISPR/Cas9技术服务协议书

T0437其它CRISPR/Cas9相关技术服务 请发送邮件到service@beyotime.com咨询。

T0438 100个定制基因敲除细胞裂解液 90天内完成。基于CRISPR/Cas9技术，并经金标准T7E1验证的100个定制基因敲除多克隆细胞裂解液。 技术标准：提供经T7E1验证的100个定制基因敲除的多克隆细胞株裂解液。293细胞或HeLa细胞任选其一，可覆盖人6000种常用基因；以全细胞裂解液或冻干粉形式提供，同时提供敲除前细胞裂解液参照；用于抗体的阳性、阴性测试及抗体特异性检测，为抗体质量检测提供更直观的证据。 下载并填写CRISPR/Cas9技术服务协议书

T0439 100个定制基因敲除细胞株 90天内完成。基于CRISPR/Cas9技术，并经金标准T7E1验证的100个定制基因敲除多克隆细胞株。 技术标准：提供经T7E1验证的100个定制基因敲除的多克隆细胞株。293细胞或HeLa细胞任选其一，可覆盖人6000种常用基因；最终提供感染靶向目的基因的Cas9慢病毒后筛选获得的多克隆细胞株各2管，每管细胞数量不少于100万；感染靶向GFP的对照慢病毒或无任何靶向的对照慢病毒(任选一个)后筛选获得的对照细胞2管，每管不少于100万。 下载并填写CRISPR/Cas9技术服务协议书

碧云天CRISPR/Cas9技术服务示例：

基于CRISPR/Cas9技术的X基因敲除细胞株的构建

  1. 根据用户提供的目的基因名称和基因ID，查找基因序列。
  2. 设计3-5条sgRNA序列。构建含puromycin抗性的sgRNA和Cas9表达质粒。

图1. 含puromycin抗性的sgRNA和Cas9表达质粒的图谱信息。
  1. sgRNA切割靶基因DNA活性检测：

图2. sgRNA切割靶基因DNA活性检测和筛选。图中显示sgRNA1和sgRNA3有较强的切割活性，而sgRNA2的切割活性很弱。

  1. 选择对靶基因DNA切割活性强的sgRNA和Cas9表达质粒，包装慢病毒并测定滴度。同时包装靶向GFP或无任何靶向的对照慢病毒并测定滴度。
  2. 慢病毒感染目标细胞株，并用puromycin进行筛选。
  3. 筛选获得的细胞株进行T7E1验证。

图3. 基因敲除细胞的T7E1法验证。敲除位点上下游设计PCR引物，提取细胞基因组DNA后进行PCR扩增。对PCR产物进行变性和退火处理后加入T7E1 (核酸内切酶，只切割碱基错配的DNA)，敲除(knockout, KO)细胞的PCR扩增产物经T7E1消化后可见明显的切割条带，说明预期的敲除位点附近存在大量sgRNA引导Cas9切割形成的缺失突变。

  1. 目的基因敲除的Western检测验证(由于涉及是否存在合适抗体用于检测的问题，本项内容不包含在常规的技术服务范围内，如果需要须另行协商)。

图4. 目的基因敲除的Western验证。筛选获得的阳性细胞传代2次后，取细胞制备蛋白样品，每孔的蛋白上样量为20μg。用抗目的蛋白X的抗体进行检测，检测Actin作为内参。标示sgGFP的为感染了靶向GFP的慢病毒后筛选获得的细胞，标示sgX的为感染了靶向目的基因X的慢病毒后筛选获得的细胞。

  1. 目的基因敲除细胞的功能分析参考图5和6(本项内容不包含在常规的技术服务范围内)。

图5. 在诱导细胞死亡的条件下，只有敲除基因X的细胞可以存活。原始细胞(naive)及阴性对照细胞(sgGFP)约80%死亡。


图6. X基因敲除影响蛋白M的磷酸化。X基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中蛋白M被特定处理诱导的磷酸化被完全抑制(A)。在通过CRISPR/Cas9技术X基因敲除的细胞中进行相同的实验，实验结果与MEF结果一致(B)。