邻近蛋白生物素标记质粒的比较和选择

邻近蛋白生物素标记质粒的比较和选择

人体由数十亿细胞组成，体内各种复杂的生命活动依赖于生物大分子之间的相互作用，其中蛋白质作为生命活动的执行者，鉴定蛋白质间的相互作用(Protein-Protein Interactions, PPIs)是阐明复杂细胞生理过程分子机制的关键。

传统的蛋白质间相互作用筛选技术：酵母双杂交(Yeast two hybrid, Y2H)和亲和纯化质谱(Affinity purification-Mass spectrometry, AP-MS)都存在局限性，例如不适用于研究膜蛋白间的相互作用，无法检测的体内蛋白质间微弱、短暂的相互作用，无法检测细胞动态变化等。近年来为有效解决上述问题，酶催化邻近标记技术被(Enzyme-Catalyzed Proximity labeling-based method)是一种具有邻近标记功能的酶与目标蛋白融合表达后，通过酶催化的共价修饰标记邻近蛋白，后续结合质谱鉴定(Mass spectrometry, MS) 蛋白质间相互作用的筛选技术广泛应用。目前主要有四种酶催化邻近标记系统：BioID (Proximity-dependent biotin identification)，APEX (engineered Ascorbate Peroxidase)，HRP (Horseradish Peroxidase)和PUP-IT (Pupylation-based Interaction Tagging)，以下对几种最新的邻近标记技术的原理及应用进行基本阐述，帮助客户了解各种邻近标记法的主要特点和差异[1]。

	BioID	APEX	HRP	PUP-IT
Enzyme Activity	Biotin ligase	Peroxidase	Peroxidase	Pup ligase
Labeling Target	Lys	Electron-rich amino acids (Tyr, trp, Cys and His)	Electron-rich amino acids (Tyr, trp, Cys and His)	Lys
Size	BioID, AirID, TurboID: 35kDa BioID2: 24KDa miniTurboID: 28kDa BASU: 29kDa	APEX, APED2: 27kDa	44kDa	54kDa
Labeling Time	BioID, BioID2: 15-24h AirID: 1-24h BASU: 1-60min TurboID, miniTurboID: 10min	1min	5-10min	24h
Incubation time with substrate	BioID, BioID2: 15-24h AirID: 3-24h BASU: 1-60min TurboID, miniTurboID: 10min	30-60min	5-10min	24h
Activation by H₂O₂	No	Yes	Yes	No
Substrates for protein labeling	Biotin	Biotin-phenol (Biotin-tyramide), Biotin-4-aminophenol, Biotin-naphthylamine	Biotin-phenol (Biotin-tyramide), Biotin arylazide, Fluorescein arylazide	Carboxylase-fused Pup (E) (bio-PupE)， Biotin-fused DE28 peptide (bio-DE28)，
Half-life of generated radicals	mins	< 1ms	< 1ms	Phosphorylated Pup (E) intermediate remains bound to Pup ligase PafA
Active region	intracellular	intracellular	extracellular, secretory pathway (inactive in cytosol)	intracellular, extracellular
Notes		Can be used as EM (electron microscopy) tag	Can be used as EM (electron microscopy) tag; HRP-conjugated antibodies available

BioID (Proximity-dependent biotin identification)

邻近依赖的生物素标记鉴定(Proximity-dependent biotin identification, BioID)技术是基于生物素连接酶(Biotin ligase, BirA)的R118G突变体BirA*。BirA可在ATP存在的条件下，高效活化生物素(D-Biotin)形成生物素酰-5'腺苷酸(Biotinoyl-5'-AMP)，并特异性地将生物素连接到Avi标签(GLNDIFEAQKIEWHE)的赖氨酸残基上，从而对目的蛋白进行快捷、高效的生物素标记；但由于BirA发生R118G突变，其活化的生物素酰-5'腺苷酸不再特异性修饰Avi标签的赖氨酸残基，而是可以对与其邻近的(~10nm)任意暴露在外的蛋白赖氨酸残基进行生物素标记[2-3]。根据生物素连接酶来源种属的不同，BioID可以进一步分为BioID (Escherichia coli), BioID2 (Aquifex aeolicus), AirID (engineered Escherichia coli by an ancestral enzyme reconstruction algorithm with metagenomics), TurboID and mini TurboID (engineered Escherichia coli by yeast surface display)和BASU (Bacillus subtilis)。 BioID具有如下优点：①适用范围广：BioID融合蛋白可以在大部分细胞中表达，除了直接相互作用的蛋白，一定范围内相邻近的蛋白也会被生物素标记，便于研究天然情况下目标蛋白与周围蛋白的相互作用；适合空间和时间上细胞的动态过程的研究，还可以提供动力学数据。②敏感性高：BioID可以有效识别无法通过酵母双杂交(Yeast two hybrid, Y2H)或亲和纯化检测的体内蛋白与蛋白之间微弱、短暂的相互作用。③克服溶解度难题：BioID特别适合研究在酵母双杂交中可溶性差或较难纯化的蛋白。④标记的蛋白易纯化、背景低：蛋白经BioID标记生物素后与Streptavidin磁珠或凝胶结合紧密，可用强去垢剂(可耐受2% SDS)洗涤，消除非特异性结合蛋白，降低背景。 BioID2基于来源于Aquifex aeolicus生物素连接酶(BirA)的R40G突变体，该突变体同样被称为BirA*，和大肠杆菌BirA的R118G突变体相似，都可以对与其邻近的任意暴露在外的蛋白赖氨酸残基进行生物素标记。BioID2技术和BioID相比具有多方面的优点：①更好的生物素标记效果：BioID分子量约35kDa (7.8nm×3.0nm)，而BioID2分子量仅约24kDa (为3.8nm×3.0nm)，因此BioID2对融合蛋白功能的影响更小，空间位阻也更小，更容易接近被标记蛋白并产生更好的标记效果。②更低的生物素浓度：BioID需在生物素浓度高于50μM的条件下才能有效标记相互作用的蛋白质，而BioID2在3.2μM生物素的条件下就可以有效标记相互作用的蛋白。BioID2所需生物素用量更少，降低了生物素对细胞功能的潜在影响。③更宽的反应温度范围：BioID最佳反应温度为37℃，而BioID2在37℃-55℃都具有良好的生物素标记活性[4]。 AirID是基于E.coli生物素连接酶利用祖先酶重建算法(ancestral enzyme reconstruction algorithm)和宏基因组学 (Metagenomics)人工改造获得的新型生物素连接酶，虽然AirID和BioID的序列相似度高达82%，但是AirID技术和BioID相比具有多方面的优点[4]：①更小的细胞毒性：AirID对细胞的毒性较小，适用于筛选生物体内蛋白的相互作用。②更低的生物素浓度：BioID需在生物素浓度高于50μM的条件下才能有效标记相互作用的蛋白质，而AirID在0.5-50μM生物素的条件下都可以有效标记相互作用的蛋白。AirID所需生物素用量更少，降低了生物素对细胞功能的潜在影响。③更高的酶活性：BioID通常需要16小时才能有效标记相互作用的蛋白质，而AirID只需要3小时就可以达到相似的效果。④更宽的反应温度范围：BioID反应温度低于37℃时酶活明显降低，而AirID在26℃-37℃都具有良好的生物素标记活性[5]。 miniTurboID是利用酵母表面展示(yeast surface display)基于E.coli生物素连接酶人工改造获得的TurboID的基础上，进一步截短、突变得到的新型生物素连接酶。miniTurboID技术和BioID相比具有多方面的优点。①更好的生物素标记效果：BioID分子量约35kDa，而miniTurboID分子量仅约28kDa，因此miniTurboID对融合蛋白功能的影响更小，空间位阻也更小，更容易接近被标记蛋白并产生更好的标记效果。②更高的生物素连接酶活性：BioID通常需要16小时才能有效标记相互作用的蛋白质，而miniTurboID最快10分钟就可以达到相似的效果。③更宽的反应温度范围：BioID反应温度低于37℃时酶活明显降低，虽然miniTurboID的最佳反应温度为30℃，但是miniTurboID在16℃-37℃也具有良好的生物素标记活性[6]。 BASU基于来源于Bacillus subtilis生物素连接酶的突变体。BASU技术和BioID相比具有多方面的优点：①更好的生物素标记效果：BioID分子量约35kDa，而BASU分子量仅约29kDa，因此BASU对融合蛋白功能的影响更小，空间位阻也更小，更容易接近被标记蛋白并产生更好的标记效果。②更高的生物素连接酶活性：BASU酶促动力学上比BioID快1000倍，BASU生物素标记1min得到的信噪比比BioID标记18h的信噪强30倍[7]。 APEX (Ascorbate Peroxidase)，中文名为抗坏血酸过氧化物酶，是基于来源于豌豆(pea)或大豆(soybean)的抗坏血酸酶经工程改造而来。在H₂O₂存在的情况下，APEX2在1min内能快速将生物素基酪氨酰胺(Biotin-tyramide，Biotin-phenol)、生物素-4-氨基苯酚(Biotin-4-aminophenol)或生物素-萘胺(Biotin-Naphthylamine, Biotin-Nap)转化为自由基，这些自由基可以标记20nm半径内无论是直接相互作用的蛋白还是邻近的蛋白任意暴露在外富含电子的氨基酸残基(Tyr, Trp, Cys or His)，后续可通过Streptavidin磁珠或凝胶从细胞裂解液中分离纯化生物素标记蛋白，并通过质谱(Mass spectrometry, MS)鉴定相互作用的蛋白(图1)。邻近蛋白生物素标记质粒在筛选和鉴定生物体内的蛋白与蛋白相互作用和探索相关功能方面发挥着至关重要的作用[8-9]。 APEX也常被用于电子显微镜细胞成像(Electron Microscopy, EM)，因此也被称作EM标签(EM tag)，其原理是表达APEX融合蛋白的细胞被固定后，加入DAB (3, 3'-diaminobenzidine)底物，在H₂O₂存在的情况下，APEX催化DAB氧化聚合交联生成局部沉淀，后续用富含密集电子的OsO4对DAB聚合物进行染色产生EM对比，后续用电子显微镜进行成像[9]。 APEX2是APEX的改进增强版本。APEX2和APEX相比的优点有：①蛋白表达量高：APEX2在哺乳细胞中稳定性更好，因此融合蛋白表达量更高。②酶活性更高：APEX2的酶活性更高，因此可以在融合蛋白表达量较低的情况下更有效的进行邻近蛋白生物素标记和电子显微镜细胞成像[10]。 HRP (Horseradish Peroxidase) ，中文名为辣根过氧化物酶，与APEX类似，也可在H₂O₂存在的情况下，应用于邻近蛋白生物素标记和电子显微镜细胞成像，但是APEX和HRP相比具有多方面的优点：①APEX在细胞质中具有酶活性：HRP在细胞质中不具有酶活性，因为在细胞质的还原性环境中HRP的4对二硫键无法形成，而且细胞质中钙离子稀少导致HRP的2个Ca²⁺结合位点空缺，所以HRP只能标记细胞膜外的蛋白，细胞膜内只能标记线粒体、内质网内的蛋白，但是APEX的酶活性不受这些因素限制，APEX可以标记细胞质中的蛋白质。②更好的标记效果：HRP分子量约44kDa，而APEX分子量仅约27kDa，因此APEX对融合蛋白功能的影响更小，空间位阻也更小，更容易接近被标记蛋白并产生更好的标记效果。③反应速度快：在H₂O₂的催化下APEX可以在1min内完成对邻近蛋白的生物素标记，因此APEX可以检测、研究细胞不同时间段“瞬间”的蛋白质间相互作用[11]。 PUP-IT (Pupylation-based Interaction Tagging)技术利用细菌中的Pup连接酶PafA，通过将邻近蛋白标记上小分子蛋白Pup来实现对蛋白质相互作用的捕捉。Pup一种小型的细菌蛋白(64aa)，C端是Gly-Gly-Gln序列，在细菌中C末端的Gln首先被脱氨形成Glu，这种形式的Pup被称为Pup(E)，在有ATP的情况下，Pup连接酶PafA会催化Pup(E) C端的Glu的磷酸化，而后将Pup(E)连接到蛋白上的Lys侧链上。这个过程类似于真核生物中的泛素化修饰(SUOMlyzation)过程，但是PafA不具有底物序列特异性，可以将Pup(E)与诱饵蛋白相互作用的任何蛋白质的赖氨酸残基上。PUP-IT与BioID和APEX、HRP传统的邻近生物素标记技术相比具有多方面的优点：①底物标记特异性高：BioID和APEX的生物素标记都依赖于被激活的底物在一个相对较大的半径内自由扩散，而PUP-IT直接将被激活的Pup(E)呈递到相互作用的蛋白质上，这样标记背景噪声较低。②更高的酶活：PUP-IT与BioID相比，PUP-IT在在体外和细胞中酶活效率更高。③适用于组织或动物：因为PUP-IT的底物是小分子蛋白，因此更容易被应用到组织或动物上，可以用于鉴定和检测体内蛋白质间的相互作用。④细胞内、外均具有酶活性：Pup连接酶PafA活性不受细胞环境影响，在细胞内和细胞外均具有酶活性[12]。

参考文献：

2022，Proximity-dependent labeling methods for proteomic profiling in living cells: An update
2016, Meet the neighbors: Mapping local protein interactomes by proximity-dependent labeling with BioID
2019，BioID: A Proximity-Dependent Labeling Approach in Proteomics Study
2016, An improved smaller biotin ligase for BioID proximity labeling
2020，AirID, a novel proximity biotinylation enzyme, for analysis of protein–protein interactions
2018，Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID
2017，RNA–protein interaction detection in living cells
2020，APEX Proximity Labeling as a Versatile Tool for Biological Research. Biochemistry
2012，Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy
2019，The cysteine-free single mutant C32S of APEX2 is a highly expressed and active fusion tag for proximity labeling applications
2015，Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling
2018，A proximity-tagging system to identify membrane protein–protein interactions