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 BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-)

  产品编号D7160
  产品包装: 2000U
  产品价格: 52.00元
产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
D7160 BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-) 2000U 52.00元

      碧云天生产的BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-),即BeyoRT™ II M-MLV reverse transcriptase (RNase H-),是一种经过改造和优化的M-MLV反转录酶,具有正常的依赖于RNA或DNA模板的DNA聚合酶活性,能够以RNA或DNA为模板,在引物存在的情况下进行互补DNA链的合成,即可以进行cDNA(complementary DNA)的第一链合成。
      本产品是最常用的反转录酶之一,广泛用于获得总RNA或mRNA后cDNA第一条链的合成,后续可以用于PCR、real-time PCR也称定量PCR(quantitative PCR, qPCR)、cDNA的第二链合成以及cDNA文库的构建等。BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-)还可以通过反转录用于DNA探针的荧光、生物素、地高辛或同位素标记等,也可以通过引物延伸(primer extention)来分析和研究RNA。
      M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus),也称MMLV或M-MuLV;反转录酶(reverse transcriptase)也称逆转录酶或RT酶。
      本产品无RNase H活性,反转录效率高、产物长度长。本产品与野生型M-MLV反转录酶相比,无RNase H活性,不能选择性剪切RNA和DNA杂合双链中的RNA,从而有助于高效合成长度更长的cDNA。本产品经测试可以轻松完成长度为8 kb及以下基因的反转录(参考图1),反转录的最大长度可以超过10 kb。

      图1. 使用BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-)反转录总RNA后,对于不同长度的cDNA进行PCR扩增后的电泳效果图。图中可见对于0.2-8kb的cDNA可以非常高效地被反转录。

      本产品热稳定性高。最适反应温度为42-45℃,但当温度达到50℃时仍具有很高活性,且可获得较高产量的cDNA (图2)。

      图2. BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-)在不同温度下的反转录效果。用从NIH3T3细胞抽提获得的总RNA 500 ng,在20μl的反转录体系中按照图中所示温度进行反转录。反转录完成后取1μl反转录产品进行目的基因的PCR扩增和电泳。

      本产品性价比高。BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-)是一种大肠杆菌重组高表达的的反转录酶,由于其表达量非常高,大大提高了本产品的性价比。本反转录酶含有从Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase基因克隆的缺失RNase H domain的pol基因,并进行了突变优化以提高其热稳定性、反转录效率和表达量。
      酶活性定义:One unit of the enzyme incorporates 1 nmol of dTTP into acid-precipitable material in 10 min at 37℃ using poly(A)·oligo(dT) 12-18 as template-primer。反应体系为 50 mM Tris-HCl(pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0.5mM [3H]-dTTP and 0.4 mM polyA·oligo(dT)12-18
      纯度:不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶和RNA酶,可以满足常规反转录合成cDNA第一条链等的需要。
      酶储存溶液:20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.01% NP-40 and 50% glycerol。
      失活或抑制:80℃孵育10分钟可以导致M-MLV反转录酶(RNase H-)失活;EDTA、EGTA等螯合剂、无机磷酸盐或焦磷酸盐以及聚氨(polyamine)对M-MLV反转录酶(RNase H-)有抑制作用。
      本产品中M-MLV反转录酶(RNase H-)的浓度为200U/μl,用于体积为20微升的反转录体系时足够进行10次反转录反应。
包装清单:

产品编号 产品名称 包装
D7160-1 BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-) 10μl
D7160-2 Reaction Buffer (5X) 0.1ml
说明书 1份

保存条件:
      -20℃保存。
注意事项: 
      对于GC含量比较高的RNA的反转录,产品的使用说明中都给予了特别说明,请予以关注。
      本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
      为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。 

使用说明:
1. cDNA第一条链的合成(First-stand cDNA Synthesis):
a. 参考如下表格中设置的20 μl反转录体系(RNase Inhibitor (R0102)和dNTP mix (D7373)可从碧云天订购):

模板(右侧3种任选其中一种) Total RNA 0.1 ng-5 μg
或poly(A) RNA/mRNA 10 pg-0.5 μg
或specific RNA 0.01 pg-0.5 μg
引物(右侧3种任选其中一种) Oligo(dT)18 primer 0.5 μg(或100 pmol)
或 Random Hexamer primer 0.2 μg(或100 pmol)
或 gene-specific primer 15-25 pmol
DEPC-treated Water To 13.7μl*

选择性步骤:如果模板RNA的GC含量较高(例如大于55%)或者有比较严重的二级结构,混匀后微离心以把液体沉降至管底,65℃孵育5min,随后立即置于冰上冷却,以打开RNA中一些比较稳定的二级结构。

Reaction Buffer (5X) 4 μl
RNase Inhibitor (40U/μl) 0.5 μl
dNTP Mix (25mM each) 0.8 μl**
BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-) 1 μl***
总体积 20μl

*To 13.7μl表示加入DEPC-treated Water至最终体积为13.7μl。
dNTP浓度不同时使用的体积需作适当调整,此时DEPC-treated Water的用量需适当调整。
如果用基因特异性引物或Oligo(dT)18反转录制备大于5kb的cDNA,则M-MLV反转录酶(RNase H-)用量宜增加至2 μl,以增加产量。
b. 轻轻混匀(用移液器轻轻吹打混匀或用涡旋混合器在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
c. 如果使用Oligo(dT)18或基因特异性引物,42℃孵育60 min。如果使用random hexamer(随机六聚体)作为引物,先在25℃孵育10 min,随后在42℃孵育60 min。
注意:对于GC含量较高或二级结构比较严重的模板RNA,可以50℃孵育60 min,以充分利用本产品在50℃时仍有良好的反转录酶活性这一特点,在较高温度进行反转录可以有效减少二级结构的干扰。
d. 80℃孵育10 min以失活BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-)并终止反转录反应。
说明:对于5kb以上的长片断cDNA不推荐采用加热的方法失活反转录酶,该方法易导致部分长片断DNA被剪切,此时可考虑酚氯仿抽提或柱纯化方法。
e. 反转录产物可以直接用于后续的PCR反应等,也可以-20℃冻存以备以后使用。用于后续PCR反应时,如果PCR的反应体系为 20和50微升,则推荐相应地使用0.8和2微升反转录产物。
2. 引物延伸、探针标记等其它用途请自行参考M-MLV反转录酶(RNase H-)的相关文献资料进行。
常见问题:
1. 总RNA反转录产物电泳观察不到。
反转录产物由于是从模板反转录而获得,而模板的量本身比较低,反转录的量通常还要少于模板量,并且总RNA的反转录产物大小很不均匀,因此通常总RNA的反转录产物直接电泳观察是观察不到的。
2. 反转录产物通过PCR扩增没有特异性条带。
a. PCR扩增没有获得特异性条带时建议先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增,看是否可以成功扩增。如果可以成功, 则说明PCR扩增体系没有问题,此时通常是目的基因的引物设计欠佳,当然也有可能是反转录产物质量欠佳。如果内参不能被很好地扩增,则有可能PCR体系存在问题或反转录产物质量欠佳。
b. 模板RNA发生了降解。哺乳动物细胞或组织的总RNA琼脂糖电泳后应该可以看到清晰的18S和28S rRNA条带,并且28S rRNA和18S rRNA的亮度比例应该大于等于2.0。如果比例小于2.0,则提示总RNA发生了显著的降解,最好能重新制备总RNA样品。
避免RNA降解的主要方法是,严格进行RNA的相关操作,包括带洁净手套、戴一次性口罩、在洁净环境中抽提或制备RNA,以尽量避免RNase污染。
c. 模板RNA的纯度偏低。在提取纯化RNA的过程中,残留在溶液中的一些成分如苯酚、SDS、EDTA、胍盐、磷酸、焦磷酸、多 胺、亚精胺等会抑制反转录酶活性。对RNA样品进行柱纯化,或者进行沉淀、洗涤和再溶解,通常可以有效去除残留的污染物。通常选择使用碧云天的BeyoZol或Trizol抽提获得的总RNA完全可以满足反转录反应的需要。
d. 反转录反应的模板量不足。在抽提获得总RNA后,在进行一些精细的定量检测时通常会进行DNase I消化,以充分去除可能的 残留的DNA的干扰。DNase I进行热失活时,需要加入EDTA至终浓度为2.5mM,否则RNA在没有螯合剂的情况下,在加热过程中容易被水解,从而导致模板量不足。此外,扩增特定基因时,需要先查询该基因的组织分布特点,利用其高表达的组织进行目的基因的反转录和克隆。用该基因丰度极低的组织或细胞样品进行反转录和PCR扩增,通常会由于模板量过少而PCR扩增失败。
e. 没有使用适当的反转录引物。对于细菌RNA和不含poly(A)尾巴的RNA,要用random hexamer引物代替Oligo(dT)18引物。使用基因特异性反转录引物时,需要确保基因特异性引物设计合理正确。
f. 如果RNA模板富含GC或容易形成二级结构,此时可以考虑把反转录温度提高到45-50℃。

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