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 T4 Polynucleotide Kinase

  产品编号D7096
  产品包装: 100U
  产品价格: 70.00元
产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
D7096 T4 Polynucleotide Kinase 100U 70.00元

      T4 Polynucleotide Kinase,简称T4 PNK,中文名称T4多聚核苷酸激酶,是一种多聚核苷酸5'羟基激酶,可以催化ATP的γ位磷酸基团向单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'羟基转移。其他NTP也可产生相同的反应:5'-OH + NTP → 5'-P + NDP。
      上述的磷酸化反应是可逆的。当缺失ATP并且存在ADP的情况下,T4 Polynucleotide Kinase可以显示出5'磷酸酯酶的活性,催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'磷酸基团向ADP的转移形成ATP。其他NTP也可产生相同的反应:5'-P + NDP → 5'-OH + NTP(最适pH为6.4左右)。
      当ATP和ADP都适量存在时,T4 Polynucleotide Kinase可以催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'磷酸基团和ATP的γ位磷酸基团之间的交换反应。其他NTP也可产生相同的反应:5'-P + NTP + NDP→5'-P + NDP + NTP。
      T4 Polynucleotide Kinase同时具有3'磷酸酯酶活性,可催化3'磷酸化的多聚核苷酸的去磷酸化:3'-P → 3'-OH + Pi(最适pH为5.9左右)。
      T4 Polynucleotide Kinase的激酶活性在C-末端附近,而磷酸酯酶活性在N-末端附近。
      用途:寡核苷酸、DNA或RNA的5'末端标记,用作Southern、Northern、EMSA等的探针,凝胶电泳的marker,DNA测序引物,PCR引物等;使寡核苷酸、DNA或RNA的5'端磷酸化,确保后续连接反应顺利进行;催化3'磷酸化的单核苷酸的5'磷酸化,使该单核苷酸可以和DNA或RNA的3'末端连接;去除3'端磷酸基团。
      来源:由大肠杆菌表达,表达基因的来源为T4嗜菌体。
      活性定义:37℃30分钟内,将转移ATP上1 nmol γ-磷酸基团转移到DNA 5'-OH末端所需的酶量定义为1个活性单位。
      酶活性检测条件:100mM Tris-HCl(pH8.0),10mM MgCl2,5mM DTT,0.5mM 5'-OH DNA,0.05mM ATP,
0.1MBq/ml [γ-33P]-ATP。
      纯度:不含DNA内切酶和外切酶,不含RNA酶。
      酶储存溶液:20mM Tris-HCl(pH7.5),25mM KCl,0.1mM EDTA,2mM DTT,50% glycerol。
      Reaction Buffer A(10X)(用于磷酸化反应):500mM Tris-HCl(pH7.6 at 25℃),100mM MgCl2,50mM DTT,1mM spermidine,1mM EDTA。
      Reaction Buffer B(10X)(用于交换反应):500mM imidazole-HCl(pH6.4 at 25℃),0.18M MgCl2,50mM DTT,
1mM spermidine,1mM EDTA,1mM ADP。
      缓冲液兼容性:在碧云天的内切酶反应缓冲液1X G、1X O、1X Y、2X Y中的活性为100%,在1X B、1X R中的活性为75-100%;在碧云天的Taq、Pfu DNA polymerase和M-MuLV反应缓冲液中的活性为50-100%。
      失活或抑制:75℃加热10分钟可使T4 Polynucleotide Kinase失活,加入EDTA也可使T4 Polynucleotide Kinase失活。金属离子螯合剂、磷酸盐、铵根离子、大于50mM的KCl和NaCl均可显著抑制T4 Polynucleotide Kinase的活性。
包装清单:

产品编号 产品名称 包装
D7096-1 T4 Polynucleotide Kinase(10U/μl) 100U
D7096-2 Reaction Buffer A(10X) 80μl
D7096-3 Reaction Buffer B(10X) 40μl
D7096-4 24% PEG Solution 40μl
说明书 1份

保存条件:
      -20℃保存。
注意事项: 
      铵盐沉淀获得的DNA不能用于T4 Polynucleotide Kinase的标记反应。铵盐可强烈抑制T4 Polynucleotide Kinase的酶活性。
      PEG可促进磷酸化反应速率和效率;交换反应体系应加入PEG。 
      酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上,使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。
      本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
      为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1. DNA 5'末端标记:
a. 参考如下表格设置反应体系:

待磷酸化DNA 1~20pmol(5'末端)
Reaction Buffer A(10X) 2μl
[γ-32P or γ-33P]-ATP (3,000Ci/mmol) 20pmol
补充无核酸酶的去离子水 至19μl
T4 Polynucleotide Kinase (10U/μl) 1μl

b. 按上表设置好反应体系后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
c. 37℃孵育30分钟。
d. 加入1μl 0.5M EDTA(pH8.0)混匀,以终止反应。
e. 后续可以使用酚氯仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化标记的DNA,也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。
DNA纯化试剂盒(D0033)可以向碧云天订购。
2. DNA 5'末端磷酸化:
a. 参考如下表格设置反应体系:

待磷酸化DNA 1~20pmol(5'末端)
Reaction Buffer A (10X) 2μl
0.1mM ATP 1μl
补充无核酸酶的去离子水 至19μl
T4 Polynucleotide Kinase (10U/μl) 1μl

b. 按上表设置好反应体系后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
c. 37℃孵育30分钟。
d. 加入1μl 0.5M EDTA(pH8.0)混匀,以终止反应。
e. 后续可以使用酚氯仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化标记的DNA,也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。
DNA纯化试剂盒(D0033)可以向碧云天订购。
3. 通过交换反应(exchange reaction)进行DNA 5'末端标记:
a. 参考如下表格设置反应体系:

待磷酸化DNA 1~20pmol (5'末端)
Reaction Buffer B (10X) 2μl
[γ-32P or γ-33P]-ATP (3,000Ci/mmol) 40pmol
24% PEG Solution 4μl
补充无核酸酶的去离子水 至19μl
T4 Polynucleotide Kinase (10U/μl) 1μl

b. 按上表设置好反应体系后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
c. 37℃孵育30分钟。
d. 加入1μl 0.5M EDTA(pH8.0)混匀,以终止反应。
e. 后续可以使用酚氯仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化标记的DNA,也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。
DNA纯化试剂盒(D0033)可以向碧云天订购。
4. 其它用途可以参考上述用途或相关文献资料进行。

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