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BeyoAP Alkaline Phosphatase
产品编号: D7027
产品包装: 200U
产品价格: 167.00元
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D7027 BeyoAP Alkaline Phosphatase 200U 167.00元

      BeyoAP Alkaline Phosphatase,即BeyoAP碱性磷酸酶,是一种热敏感的,可以催化DNA、RNA、核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸水解释放5′或3′末端磷酸基团的酶,也可以脱去蛋白质丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上的磷酸基团。BeyoAP Alkaline
Phosphatase是一种新型碱性磷酸酯酶,在碧云天的各种内切酶和PCR缓冲液中可保持100%活性,对于各种类型的DNA 5′末端的去磷酸化均可在37℃孵育10分钟即可完成,并且75℃孵育5分钟即可完全失活。
      碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, AP/ALP/AKP/ALKP/ALPase/Alk Phos)常被称作碱性磷酸酯酶(EC 3.1.3.1),是一类水解酶,通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去,并生成磷酸根离子和自由的羟基,其去磷酸化作用的底物包括核苷酸、蛋白质和生物碱等,并在碱性条件下最为有效。该酶是一组同功酶的统称。常见的小牛肠碱性磷酸酶(Calf Intestinal Alkaline
Phosphatase, CIAP/CIP)被广泛用于二抗等的标记最终用于蛋白和核酸等的检测,也常用于DNA或RNA 5'和3'末端的去磷酸化(去单磷酸化),特别是质粒的5'末端去磷酸化以避免质粒自连等。
      经限制性内切酶酶切的质粒5′端带有磷酸基团,在进行基因克隆时为避免质粒自连,可以使用BeyoAP Alkaline
Phosphatase去除5′末端磷酸基团。脱去5′末端磷酸基团的质粒不能发生自连。
      特点:快速去磷酸化,只需37℃孵育10分钟即可;快速失活,75℃孵育5分钟即可完全失活;使用方便,在各种内切酶和PCR缓冲液中保持100%活性,可以和质粒DNA的消化同时进行;操作步骤简单,对于5′或3′突出末端、平端等各种DNA的脱磷酸化采用完全相同的操作步骤;可直接用于连接反应,经BeyoAP Alkaline Phosphatase脱磷,并75℃孵育5分钟失活后可直接用于后续的连接反应。
      用途:通过去除载体或DNA片段5′末端的磷酸基团,防止载体或DNA片段自连;质粒DNA的同时内切酶消化和脱磷;通过5′末端脱磷,为5′末端磷酸化放射性标记准备模板;去除DNA、RNA 5′或3′末端的磷酸基团;用于蛋白质丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基的去磷酸化。
      来源:大肠杆菌表达,表达基因为一种细菌碱性磷酸酯酶基因。
      酶活性定义:37℃10分钟内,催化1μg 线性化的pUC19 DNA5′末端脱磷所需的酶量定义为一个活力单位。
      纯度:不含DNA外切酶和内切酶,不含RNA酶。
      酶储存溶液:20mM HEPES-NaOH(pH7.4),1mM MgCl2,0.1mM ZnCl2,0.1% Triton X-100,
50%(v/v)glycerol。
      Reaction Buffer(10X):100mM Tris-HCl(pH8.0 at 37℃),50mM MgCl2,1M KCl,0.2% Triton X-100,10mM 2-mercaptoethanol,1mg/ml BSA。
      失活或抑制:75℃加热5分钟可以使BeyoAP Alkaline Phosphatase失活。金属离子螯合剂对BeyoAP Alkaline
Phosphatase有抑制作用。
包装清单:

产品编号 产品名称 包装
D7027-1 BeyoAP Alkaline Phosphatase(1U/μl) 200U
D7027-2 Reaction Buffer(10X) 0.5ml
说明书 1份

保存条件:
      -20℃保存。
注意事项: 
      酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上,使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。
      本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
      为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。 

使用说明:
1. 质粒DNA同时进行内切酶消化和5′末端脱磷:
a. 参考如下表格设置去磷酸化反应:

质粒DNA 1μg
内切酶的Reaction Buffer(10X) 2μl
补充无核酸酶的去离子水 至18μl
内切酶 1μl
BeyoAP Alkaline Phosphatase(1U/μl) 1μl

b. 按上述体系配好之后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
c. 37℃孵育60分钟。注意:如果质粒DNA消化和脱磷后用于后续的连接反应,推荐先参考上表进行内切酶消化,但不加入BeyoAP Alkaline Phosphatase。内切酶消化6-16小时后,再加入BeyoAP Alkaline Phosphatase 37℃孵育10分钟。内切酶消化时间比较长,可以大大减少自连克隆出现的几率。
d. 75℃加热5分钟或根据内切酶失活的其他条件进行酶的失活。
e. 后续可以使用酚氯仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化已消化并且脱磷酸化的DNA,也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。DNA纯化试剂盒(D0033)可以向碧云天订购;如果切出的片段大于50bp,通常需要进行DNA凝胶电泳和切胶回收。DNA凝胶回收试剂盒(D0056)可以向碧云天订购。
2. DNA、RNA的5′或3′末端脱磷
a. 参考如下表格设置去磷酸化反应:

待脱磷的DNA或RNA 1--5μg(up to 10pmol termini)
Reaction Buffer(10X) 2μl
补充无核酸酶的去离子水 至19μl
BeyoAP Alkaline Phosphatase(1U/μl) 1μl

b. 按上述体系配好之后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
c. 37℃孵育10分钟。
d. 75℃加热5分钟失活BeyoAP Alkaline Phosphatase。
e. 后续可以使用酚氯仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化已消化并且脱磷酸化的DNA,也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。DNA纯化试剂盒(D0033)可以向碧云天订购;如果切出的片段大于50bp,通常需要进行DNA凝胶电泳和切胶回收。
说明:上述脱磷反应可以用于5′或3′突出的DNA,也可以用于平末端DNA,反应条件相同,即均为37℃孵育10分钟。
3. 蛋白去磷酸化
a. 参考如下表格设置去磷酸化反应:

待去磷酸化的蛋白 1--10μg
Reaction Buffer(10X) 5μl
补充无核酸酶的去离子水 至45μl
BeyoAP Alkaline Phosphatase(1U/μl) 5μl

b. 按上述体系配好之后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
c. 37℃孵育60分钟。
d. 加入EDTA至终浓度为50mM或加入钒酸钠至终浓度为10mM以终止去磷酸化反应。
注意:酶的最佳用量和37℃的最佳孵育时间需根据特定蛋白自行进行优化。
4. 其他用途请参考上述用途或碱性磷酸酶的相关文献资料进行。

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